כרומטוגרפיה

מתוך ויקיפדיה, האנציקלופדיה החופשית

כרומטוגרפיה (Chromatography) היא שיטה בכימיה אנליטית המאפשרת הפרדה של חומרים המצויים בתערובת, זיהויים וקביעת כמוּתם. בנוסף לשימושים המדעיים הרבים שיש לכרומטוגרפיה, ניתן לפגוש בה רבות בתחום הזיהוי הפלילי, בתעשיית המזון, בתעשיית התרופות ובבתי חולים.

תוכן עניינים 1 עקרון 2 היסטוריה 3 שיטות כרומטוגרפיות על-גבי משטח 3.1 כרומטוגרפיית נייר 3.2 כרומטוגרפיית שכבה דקה 4 שיטות כרומטוגרפיות בעמודה 4.1 כרומטוגרפיית זיקה 4.2 כרומטוגרפיית חילוף יונים 4.3 כרומטוגרפיית גודל המולקולה 5 שיטות כרומטוגרפיות מתקדמות 5.1 כרומטוגרפיית גז 5.2 כרומטוגרפיית נוזל בלחץ גבוה

[עריכה] עקרון

לסוגי הכרומטוגרפיה הרבים עקרון פעולה משותף. התערובת שאותה רוצים להפריד מומסת בנוזל או בגז (או שהיא בעצמה נוזל או גז); בחלק מסוגי הכרומטוגרפיה מוזרם הנוזל או הגז (המכונה פאזה נעה או ניידת) בצינור או שפופרת שדפנותיו הפנימיות מצופות במוצק או ג'ל (המכונה פאזה נחה או נייחת); לעתים ממלאת הפאזה הנחה את הצינור כולו. בסוגי כרומטוגרפיה אחרים את הצינור מחליף משטח (נייר, פלסטיק או אחר) המהווה את הפאזה הנחה, והפאזה הנעה נודדת על גביו.

בין שתי הפאזות נוצרות אינטראקציות כימיות (לא תגובות כימיות). בדרך-כלל מדובר במשיכות חשמליות הנובעות מההבדלים בקוטביות של החומרים השונים המעורבים. לעתים מדובר בהבדלים במסיסות או בכושר ההיספגות של החומרים השונים. היות וחוזקן של האינטראקציות בין הפאזה הנחה ובין המרכיבים השונים של הפאזה הנעה שונה ממרכיב למרכיב, זורם חלק מהמרכיבים במהירות לקצה הצינור או הנייר, ואילו חלק אחר זורם באיטיות. כך מופרדת התערובת למרכיביה.

את התוצאות ניתן לראות בשלושה אופנים:

• בסוגי כרומטוגרפיה פשוטים, בהם ההפרדה נעשית על נייר או משטח אחר, ניתן לראות בעין את החומרים שהופרדו מהתערובת, בתנאי שהם בעלי צבע.
• אם הם חסרי צבע, ניתן להוסיף שיירים אולטרה-סגולים לתערובת, לפני ההפרדה, ולאחר מכן לחשוף את הנייר לאור אולטרה סגול (UV). ניתן, כשיטה נוספת, להוסיף פיגמנטים שונים הצובעים את מרכיבי התערובת.
• בסוגי כרומטוגרפיה מתקדמים, בהם ההפרדה נעשית בצינור, קיימים גלאים אלקטרוניים משוכללים בקצה הצינור. הללו מזהים את החומרים, לפי סדר הגעתם, ומתרגמים (בעזרת מעבד) את הנתונים לשם הצגתם באופן גרפי (על גבי צג או כהדפס).

[עריכה] היסטוריה

מקור המילה כרומטוגרפיה ביוונית: כרומה פירושו "צבע", גרפיה פירושו "כתיבה". נראה כי אין קשר רב בין פירוש המילה לבין השיטה עצמה; ואכן, השם הוענק לשיטה על ידי ממציאה, הבוטנאי הרוסי מיכאיל צבט, והיא מתייחסת ראשית לשמו (צבט ברוסית פירושו "צבע") ושנית לחומר שביקש לבודד בנסיונותיו הראשונים: הפיגמנט כלורופיל, המקנה לצמחים את צבעם הירוק.

צבט פיתח את השיטה בשנת 1901, למרות שעקרונותיה היו ידועים עוד לפני כן; תרומתו של צבט הייתה ביישום העקרונות לשימוש מעשי. צבט לא הצליח לפרסם את שיטתו במידה רבה, אולי כיוון שכתב את עבודותיו רק ברוסית. במהלך המאה ה-20 התפתחה הכרומטוגרפיה בצעדים משמעותיים; ב-1952 זכו שני בריטים בפרס נובל לכימיה על פיתוח תאוריות מתקדמות וכמה סוגים של כרומטוגרפיה.

[עריכה] שיטות כרומטוגרפיות על-גבי משטח

[עריכה] כרומטוגרפיית נייר

בשיטה פשוטה זו הפאזה הנחה היא רצועת נייר (העשוי ברובו מתאית), שבמרכזה מניחים טיפה מהתערובת שרוצים להפריד (יש לוודא שאף אחד ממרכיביה לא עלול להגיב עם הנייר). הנייר מוטבל בקצהו אל תוך הפאזה הנעה - מים או אתנול, למשל. הפאזה הנעה מתחילה "לטפס" במעלה הנייר; כשהיא פוגשת את טיפת התערובת היא גוררת את מרכיביה איתה. עתה מתבצעת ההפרדה: מרכיבי התערובת שאינם יוצרים אינטראקציות חזקות עם מולקולות הנייר מטפסים במהירות עם הפאזה הנעה אל קצה הנייר; המרכיבים שיוצרים אינטראקציות עם הנייר מזדחלים באיטיות. התוצאה המתקבלת היא שורה של נקודות, כל אחת מייצגת אחד ממרכיבי התערובת.

את התוצאות ניתן להשוות לתוצאות ידועות של החומרים המדוברים. ניתן לחשב את שיעור הנדידה של כל חומר, ולהשוות עם ערכים ידועים הכתובים בספרות. שיעור הנדידה (מסומן RF) שווה למרחק שנדד החומר (2 ס"מ, לדוגמה) חלקֵי המרחק שנדדה הפאזה הנעה (5 ס"מ, למשל; במקרה זה שווה ה-RF ל-0.4).

בכרומטוגרפיית נייר דו-ממדית מסובבים את הנייר באמצע התהליך ב-90 מעלות. כתוצאה מכך נוצרת הפרדה כפולה, מדויקת יותר; זו משמשת בדרך-כלל להפרדת תערובות בעלות מספר רב של מרכיבים דומים מאוד.

[עריכה] כרומטוגרפיית שכבה דקה

שיטה זו, הידועה יותר כ-TLC (באנגלית: Thin Layer Chromatography), זהה לכרומטוגרפיית נייר, אלא שכאן הפאזה היא משטח (זכוכית, נייר אלומיניום או פלסטיק) המצופה חומר סופג (סיליקה, אלומינה או תאית, למשל). השיטה מהירה ומדויקת יותר מכרומטוגרפיית נייר, והיא משמשת רבות בכימיה אורגנית.

[עריכה] שיטות כרומטוגרפיות בעמודה

[עריכה] כרומטוגרפיית זיקה

בשיטה זו, הידועה גם ככרומטוגרפיית אפיניות והמשמשת בעיקר להפרדת חלבונים, הפאזה הנחה ממלאת עמודת הפרדה (Column, למעשה צינור פשוט). את הפאזה הנעה - נוזל המכיל את התערובת - מוזגים אל הפתח העליון של העמודה. התערובת מחלחלת לאיטה דרך העמודה, כשמרכיביה נודדים במהירויות שונות, עד שהיא מגיעה לתחתית. הפאזה הנחה מכילה ליגנד (מולקולה קטנה העשויה להיקשר לחלבונים, למשל); עקרון ההפרדה מבוסס על היקשרות הליגנד לחלבון. כשמבצעים כרומטוגרפיית אפיניות, יש לדעת מראש אילו חלבונים מצויים בתערובת, ולבחור את הליגנד בהתאם. החלבון שאנו מעוניינים לבודד נקשר לליגנד שבעמודה, ואילו שאר החלבונים בתערובת מחלחלים לתחתית ויוצאים מהעמודה.

[עריכה] כרומטוגרפיית חילוף יונים

בשיטה זו, הידועה יותר כ-IEC (באנגלית: Ion-Exchnage Chromatography), הפאזה הנחה בעמודה מורכבת מגרגרים קטנטנים הטעונים חשמלית. אם הפאזה טעונה שלילית, למשל, מולקולות הנמצאות בתערובת שיש להפריד והטעונות חיובית יימשכו לגרגרים, ונדידתם במורד העמודה תיעצר. מולקולות טעונות שלילית ימשיכו לנדוד לתחתית וייצאו מהעמודה.

[עריכה] כרומטוגרפיית גודל המולקולה

שיטה זו קרויה באנגלית SEC (ראשי תיבות של Size-Exclusion Chromatography) או GEP (ראשי תיבות של Gel-Permeation Chromatography). שיטה דומה היא GFC (ראשי תיבות של Gel-Filtration Chromatography). שתי שיטות אלו מפרידות מולקולות על-סמך ההבדלים בגודלן. העמודה מכילה ג'ל בעל חריצים זעירים. מולקולות קטנות נתקעות בחריצים ונדידתם נעצרת; מולקולות הגדולות מהחריצים ממשיכות לנדוד לתחתית ויוצאות מהעמודה. באופן מעניין, שיטה זו הפוכה לאלקטרופורזה; גם שם משתמשים בג'ל בעל חריצים, אך באלקטרופורזה מולקולות גדולות דווקא נודדות לאט יותר מאשר מולקולות קטנות. הסיבה לכך היא שבאלקטרופורזה החריצים לא מיועדים לגרימת עצירה מוחלטת של המולקולות; החריצים גורמים לעיכוב כל המולקולות בתערובת, קטנות כגדולות. הגדולות יותר נודדות באיטיות עקב משקלן הרב.

[עריכה] שיטות כרומטוגרפיות מתקדמות

[עריכה] כרומטוגרפיית גז

בשיטה זו (GC), הפאזה הנעה היא גז (אציל, על-מנת שלא יגיב עם החומרים בתערובת). ההפרדה נעשית בעמודת הפרדה או בנים (Capillary) דק וארוך (אורכו עשוי להגיע ל-100 מטרים). שיטה זו מתאימה רק לחומרים המתאדים או רותחים בטמפרטורות נמוכות יחסית. זיהוי החומרים המופרדים נעשה על-ידי גלאים משוכללים, המתרגמים את הנתונים לצורה גרפית.

זמן הנדידה של כל אחד מהחומרים בתערובת - הזמן שעובר עד שהם חוצים את העמודה לאורכה - תלוי בנקודת הרתיחה שלהם, בעיקר, ופחות באינטראקציות עם הפאזה הנחה. לפיכך, השיטה יעילה במיוחד להפרדה של סדרות הומולוגיות - תרכובות אורגניות המשתייכות לאותה משפחה, אך הנבדלים זה מזה באטום פחמן אחד (לדוגמה: האלקאנים מתאן, אתאן, פרופאן, בוטאן). כל אטום פחמן נוסף מגביר את חוזקה של המולקולה, ובכך את נקודת הרתיחה שלה; לכן החומרים מגיעים אל הגלאי לפי סדר גודל המולקולה.

ההפרדה ב-GC נעשית במהירות, תוך מספר דקות. אחד מחסרונות השיטה הוא שהתערובת הנבדקת רותחת ונהרסת; אם לא ניתן לוותר עליה, יש להשתמש בשיטה אחרת. חסרון נוסף הוא מחירם של מכשירי ה-GC, המתחיל בעשרות אלפי דולרים.

[עריכה] כרומטוגרפיית נוזל בלחץ גבוה

בשיטה זו, הידועה כ-HPLC (באנגלית: High Pressure Liquid Chromatography), מומסת התערובת בפאזה הנעה (ממס זה או אחר), המוזרק בלחץ גבוה אל עמודה או נים. גם כאן מחכה לחומרים גלאי בקצה העמודה, המתרגם את הנתונים לצורה גרפית. ב-HPLC, אולם, ההפרדה מבוצעת על-ידי הבדלים בקוטביות של חומרי התערובת. חומרים קוטביים (הידרופיליים) נמשכים לפאזה הנחה ונשארים זמן רב יותר בעמודה, וחומרים הידרופוביים (שומנים, למשל) ממהרים להגיע לקצה. גם שיטה זו טובה להפרדת סדרות הומולוגיות, שכן כל אטום פחמן נוסף מוריד מקוטביות המולקולה.

ב-HPLC מהופך (Reversed Phase (RP) HPLC) הפאזה הנחה היא הידרופובית, בניגוד ל-HPLC הרגיל, בו היא הידרופילית. לפיכך, החומרים מגיעים אל הגלאי בסדר הפוך.

HPLC הוא סוג הכרומטוגרפיה הנפוץ ביותר; 80% מההפרדות מבוצעות בשיטה זו. גם כאן מהווה המחיר הרב חסרון, ולעתים מכונה השיטה בהיתול High Price Liquid Chromatography (כרומטוגרפיית נוזל במחיר גבוה).