Genetická daktyloskopie
Z Wikipedie, otevřené encyklopedie
Analýzu DNA lze provést prakticky z každého typu lidské tkáně. I ze zdrojů, které jsou na DNA poměrně chudé - z kostí, nehtů, vlasů, šupinek kůže atd. Analytických metod, které se používají při porovnávání vzorků DNA, ať už v kriminalistice, nebo například v testech rodičovství, je celá řada a mnohdy se jejich použití prolíná a kombinuje. Nejpoužívanější metody jsou:
Obsah |
[editovat] PCR
PCR (Polymerase Chain Reaction) - slouží k vytvoření až mnoha milionů exaktních kopií vzorového fragmentu DNA o maximální délce 10 tisíc nukleotidů (v některých případech bylo dosaženo délky až 40 tisíc), což umožňuje provést analýza DNA i z velmi malého vzorku.
[editovat] RADP
RAPD (Random-amplified polymorphic DNA) - méně přesná metoda, používaná občas jako předtest, pro svou nenáročnost a rychlost.
[editovat] STRP
STRP (Short Tandem Repeat Polymorphism) a VNTR (Variable Number Tandem Repeats) - moderní, dnes nejpoužívanější metody jsou podobné metody RFLP, která však pracují s jinak získanými fragmenty DNA. 99% DNA mají všichni lidé společnou. V DNA se však vyskytují místa, která neslouží ke kódování genů, a která jsou tvořena opakováním krátkého motivu, jakéhosi „slova“, které tvoří mnohokrát opakovaný sled 2 - 4 nukleotidů, např. -CACG-CACG-CACG-. Říkáme jim tandemové repetice a v lidské DNA jich dnes známe více než 8 tisíc. Podoba těchto repetic a jejich délka je výrazně individuální. Je to způsobeno tím, že jejich mutace nemají pro člověka pravděpodobně žádný význam, jelikož nekódují žádnou genetickou informaci. Naproti pokud by mutace postihla některý esenciální gen, pravděpodobně by tím zásadním způsobem poškodila správné fungování genu a možná i zabránila přežití takovéhoto jedince, což velmi efektivně odstraňuje podobné odchylky ze společnosti. Při testování se postupem, podobným tím, který je použit při RFLP (PCR, Agarose gel elektroforesis, Southern blot) určí, jak je vybraná tandemová repetice u daného člověka dlouhá, tedy kolika opakováními „slova“ je tvořena. Stejně se postupuje i u dalších repetic - celkem se jich obvykle zkoumá 15, pokud není potřeba vyšší počet. Přesnost výsledků této metody je, stejně jako u RFLP, blízká 100%.
[editovat] RFLP
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) - klasická metoda zjišťování genetického profilu, která se již dnes nepoužívá tak často, jako dříve.
Postup provedení genetického testu metodou RFLP:
1. Nejprve je nutné molekulu DNA izolovat z buňky a očistit od případných nečistot (nejčastěji bílkoviny, fenol a agarosa). K extrakci a purifikaci DNA, které musí předcházet izolace jader pomocí centrifugace, se používá například guanidinhydrochlorid, obvykle ve směsi s dalšími látkami. Kontrola čistoty vzorku se měří pomocí spektrofotometrického měření v UV světle, při menším vzorku, nebo větší míře výskytu nečistot se přesnější určení koncentrace nukleové kyseliny dá zjistit z intenzity fluorescence emitované ethidiumbromidem.
2. Pokud již je vyextrahován vzorek DNA, je dalším krokem rozštěpení molekuly na jednotlivé malé fragmenty. V současnosti je známo přibližně 1500 restrikčních endonukleas, která dokáží rozeznat krátké sekvence nukleotidů (4, 6, 8) a podle rozeznané sekvence dokáží DNA v konkrétním místě rozštěpit. Jejich použití vede k fragmentaci DNA na díly, které jsou specifické pro každého člověka, jelikož přesné pořadí bází se u každého člověka, vyjma jednovaječných dvojčat, liší. Výsledkem je směs různě velikých úseků DNA.
3. Směs se vlije k jednomu konci nádoby s tenkou vrstvou speciálního agarosního gelu – porézní, gelovité hmoty.
4. Uvnitř nádoby se vytvoří elektrická polarita, záporný pól je na straně umístění fragmentů DNA. To vede k tomu, že jsou fragmenty vypuzovány směrem k druhé straně, protože mají lehce záporný náboj. Jelikož se však liší svými rozměry, jejich pohyb skrze porézní agarosní gel je různě rychlý, menší fragmenty se pohybují rychleji a na větší vzdálenost. Tato metoda, která rozdělí fragmenty v závislosti na jejich velikosti se nazývá „Agarose gel electrophoresis“.
5. Takto rozložený vzorek fragmentů DNA není možné dále zkoumat přímo na agarosním gelu, proto se na povrch gelu umístí tenká nylonová, nebo nitroceluosová, membrána do které jsou fragmenty „nasáty“. Tomu předchází denaturace DNA za pomoci zásady, obvykle hydroxidu sodného. Na závěr je nylonová membrána ozářena paprsky UV, které způsobí trvalé umístění fragmetů na membránu.
6. Na nylonovou membránu s fragmenty se nalijí připravené sondy, které byly radioaktivně označeny. Ty se připojí k fragmentům na membráně, pokud jsou s nimi komplementární. Nenavázané sondy jsou odstraněny.
7. Na membránu je umístěn X-ray film. Sondy, které jsou nyní rozmístěny pouze v některých částech membrány, vyvolají expozici filmu v odpovídajících částech. Film je dán k vyvolání a „DNA fingerprint“, složený z proužků různé tloušťky a různých rozestupů je vytvořen. Tato metoda (bod 5-7) se nazývá „Southern blot“ podle vynálezce Edwina Southerna. To způsobilo, že i další, podobné metody se jmenuje podobně, konkrétně „Northern blot“ a „Western blot“. Kromě toho existují ještě „Slot blot“ a „Dot blot“. Ty se odlišují pravidelným tvarem naneseného vzorku sond (slot – protáhlý, pravidelný tvar, dot – kruhový, pravidelný tvar). Možností je také tzv. „Revers blotting“, během něhož je nejprve na membránu nafixována sonda a až poté hybridizovaná DNA ze zkoumaného vzorku.
Při testech rodičovství se též používají technologie, které porovnávají přímo mitochondriální DNA, která se dědí pouze od matky a je tudíž výborně prokazatelná. U mužských potomků se stejně tak porovnává chromozóm Y s otcovým.
