Ligation-During-Amplification
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Ligation-During-Amplification (LDA) ist eine molekularbiologische Methode zur linearen Amplifikation von zirkulärer DNA (z.B. Plasmid) mit nur einem sequenzspezifischen Primer unter Verwendung einer thermostabilen DNA-Polymerase sowie einer thermostabilen DNA-Ligase.
Diese Methode wird genutzt zur gezielten Mutagenese von Plasmiden. Dabei wird mit einem mutagenen Primer ein Strang der zirkulären Plasmid-DNA (Template) in einem Thermocycler in mehreren Zyklen linear amplifiziert und ligiert. Anschließend wird die parentale, methylierte Plasmid-DNA (Template) mit dem Restriktionsenzym DpnI, welches nur dam methylierte DNA spaltet, abgebaut. Danach wird die amplifizierte, mutierte, einzelsträngige, zirkuläre DNA in Bakterien transformiert und dort zur doppelsträngigen Plasmid-DNA vervollständigt.
Im QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit von Stratagene wird ebenfalls die Methode der LDA-Mutagenese mit nur einem Primer genutzt. Im Gegensatz dazu wird im normalen QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit die Methode der PCR-Mutagenese mit zwei Primern verwendet.
[Bearbeiten] Weblink
- Lab-Protokol (PDF Format)
[Bearbeiten] Literatur
- Chen, Z and Ruffner, D.E. (1998). Amplification of closed circular DNA in vitro. Nucleic Acids Res. 26, 1126-1127. PMID 9461478 PMC (freier Volltextzugriff)
- Shenoy, A.R. and Visweswariah, S.S. (2003). Site-directed mutagenesis using a single mutagenic oligonucleotide and DpnI digestion of template DNA. Anal. Biochem. 319, 335-336. PMID 12871732 DOI
- Sawano, A. and Miyawaki A. (2000). Directed evolution of green fluorescent protein by a new versatile PCR strategy for site-directed and semi-random mutagenesis. Nucleic Acids Res. 28, E78. PMID 10931937 PMC (freier Volltextzugriff)
