ELISA

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ELISA è l'acronimo dell'espressione inglese Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne è probabilmente affetto.

ELISA trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di anticorpi nel plasma sanguigno, come ad esempio nei test per l'AIDS.

ci sono due varianti del test ELISA una é chiamata ELISA COMPETITIVO e l'altro ELISA NON COMPETITIVO.

Esistono inoltre due metodiche di ELISA NON COMPETITIVO: il metodo diretto o DAS-ELISA e il metodo indiretto. Nel metodo diretto le più fasi in sintesi prevedono:

Immissione di una soluzione dell'anticorpo primario, specifico per l'antigene da individuare, nei pozzetti di una apposita piastra da saggio in polistirene, saturazione del fondo del pozzetto con l'anticorpo, e lavaggio con soluzione tampone; L'anticorpo primario aderisce al fondo dei pozzetti per mezzo solitamente di gelatina di pesce e l'eccesso viene lavato via.
Aggiunta, in soluzioni con diverse concentrazioni non note, dei campioni dei quali bisogna saggiare la presenza, o meno, dell'antigene caratteristico dell’organismo patogeno e lavaggio con soluzione tampone; L'antigene, se presente, si lega specificamente con l'anticorpo e l'eccesso viene lavato via.
Aggiunta dell'anticorpo secondario, coniugato con un enzima (da cui il nome del test), tipicamente perossidasi o fosfatasi alcalina, e lavaggio con soluzione tampone; L'anticorpo secondario si lega selettivamente all'antigene, se presente, e l'eccesso viene lavato via. L’assenza dell’antigene specifico per l’anticorpo comporta che l’anticorpo secondario (e il relativo enzima ad esso coniugato), con il lavaggio, venga dilavato.
Aggiunta di p-nitrofenilfosfato; Questa sostanza provoca una reazione con l'enzima coniugato all'anticorpo secondario producendo p-nitrofenolo di colore giallo. Se l’antigene caratteristico dell’organismo patogeno è assente nel pozzetto non vi sarà neanche l’enzima coniugato all’anticorpo secondario - la reazione non può avvenire.
Aggiunta di idrossido di sodio per bloccare la reazione tra enzima fosfatasi e p-nitrofenilfosfato;
Lettura del risultato, espressione della reazione tra enzima fosfatasi e p-nitrofenilfosfato che produce sul substrato una reazione cromogenica o fluorogenica - ovvero sviluppo di colore o luce di fluorescenza - successivamente misurabile attravecrso uno spettrofotometro.

Nel test ELISA NON COMPETITIVO indiretto l'antigene è legato al pozzetto e dato che al pozzetto della piastra è legato l'antigene non si può avere la formazione del sandwich, ma un anticorpo si legherà all'antigene, se presente, e un anticorpo secondario marcato con un enzima si legherà al complesso antigene-anticorpo riconoscendolo.

Lo sviluppo del colore è indicativo della presenza dell'antigene che si voleva saggiare e l'intensità della colorazione, misurabile grazie al spettrofotometro, è semi-quantitativa secondo una scala arbitraria di intensità.

Il test è da intendersi valido se la reazione risulta positiva nel pozzetto di controllo dove è sicuramente presente l'antigene e negativa nel pozzetto di controllo dove l'antigene sicuramente non è presente.

Il test ELISA NON COMPETITIVO è un test qualitativo e semi-quanntitativo: non fornisce un valore effettivo ma afferma la presenza o l'assenza dell'analita. Il test ELISA COMPETITIVO è un test quali-quantitativo: fornisce un valore specifico con una deviazione standard