Green Fluorescent Protein
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La proteina detta Green Fluorescent Protein (GFP), normalmente espressa nella medusa Aequorea victoria, è costituita da 238 amminoacidi (PM = 27000). Assorbe la luce con un massimo di eccitazione a 395 nm (luce blu) e fluoresce con un massimo di emissione di 510 nm (luce verde). Nella struttura quaternaria è possibile notare un foro centrale nella proteina, accessibile al solvente polare. Questo foro è necessario per l’attività fluorescente della proteina. La luminescenza di GFP è un fenomeno intrinseco alla stessa proteina e non richiede substrati quindi è molto usata come marcatore nelle indagini di identificazione e localizzazione subcellulare delle proteine. In questi saggi la sequenza nucleotidica della proteina X interessata viene fusa con la sequenza nucleotidica di GFP in un vettore di espressione che solitamene è un plasmide. Il plasmide ricombinante viene inserito nella cellula eucariotica, solitamente tramite elettroporazione, in modo che una volta all'intenro della cellula il plasmide si integri nel genoma per ricombinazione omologa sito specifica all'intenro del gene per la proteina X. Questo processo porta all'inattivazione del gene selvatico per X e all'espressione del gene ricombinante per X-GFP. L'dentificazione e localizzazione subcellulare di X-GFP può allora essere visualizzata tramite la microscopia a florescenza che rivela i segnali prodoti da GFP e che quindi identificano anche X. Quest tecnica è molto potente in quanto la localizzazione della proteina studiata viene rivelata in vivo ed è possibile seguirla anche nel tempo.
