Полимеразна ланчана реакција

Из пројекта Википедија

Ланчана реакција полимеразе (енглески Polymerase Chain Reaction - PCR) је методa којoм се умножава молекул ДНК. Мeтодa омогућава стварање великог броја копија користећи мали почетни узорак молекула ДНК. Полимеразна ланчана реакција се често користи у медицинским и биолошким лабораторијама и има примену у детекцији наследних болести, идентификацији генетског отиска, дијагнози инфективних болести, клонирању гена и тестирању очинства.

Садржај 1 Историја 2 ПЛР у пракси 3 Кораци реакције 4 Литература 5 Референце

[уреди] Историја

Методу је створио и разрадио Кери Малис децембра 1983. За ово откриће је 1993. добио Нобелову награду за хемију, седам година након објављивања првобитних идеја о методи. Мaлисова замисао је била да развије процес помоћу којег би се вештачким путем увећавао број молекула ДНК у циклусима репликације омогућеним ензимм ДНК полимеразе.

ДНК полимераза се природно јавља у живим организмима, у којим има функцију да копира ДНК када се ћелија дели током митозе и мејозе. Полимераза копира тако што се веже на један, од два полинуклеотидна ланца које чине ДНК, и ствара ланац комплементаран оригиналу. У Мулисовој првобитној методи ензим је коришћен у контролисаном окружењу ван организма. Два полинуклеотидна ланца ДНК који су спирално увијени један око другог би се прво раздвојили грејањем молекула до 96°С. Међутим при овој температури ензим који је у оно време коришћен бивао је уништен, те је ензим морао бити поново додат након сваког циклуса. Мулисова првобитна замисао је била веома неефикасна, јер је захтевала пуно времена, огромне количине ДНК полимеразе и сталну пажњу током целог процеса.

Касније, оригинална метода ПЛР (PCR) је значајно побољшана употребом ДНК полимеразе нађене код термофилних бактерија које живе у гејзирима на температурама од преко 110°С. ДНК полимераза узета од оваквих организама је довољно стабилна при високим температурама и не долази до уништења када се користи током ПЛР процеса. Како није било више потребе додавати нове ензиме ДНК полимеразе након сваког циклуса да замени ензиме уништене температуром, цео процес копирања ДНК молекула је постао једноставнији и бржи.

[уреди] ПЛР у пракси

ПЛР ce користи за копирање кратког унапред одређеног дела молекула ДНК. То може да буде или један ген или само део гена. PCR процес може да копира само кратке ДНК фрагменте, обично до 10 кб (кб= кило, 1000 парова база). Различити молекуларни протоколи могу да копирају фрагменте и до 40 кб, мада је и та величина мања од хромозалног ДНК молекула еукариотске ћелије, на пример, људска ћелија садржи око три милијарде нуклеотида.

Да би реакција била могућа потребне су следеће компоненте:

• ДНК молекул који ће служити као образац за копирање комплементарног ланца
• Два прајмера који обележавају почетак и крај оног дела ланца који се синтетише
• Ензим ДНК полимераза, који врши само копирање
• Нуклеотиди, помоћу којих ензим ДНК полимераза гради нови молекул ДНК

PCR реакција је могућа у посебној машини. Ова машина греје и хлади пластичне тубе, које садрже како молекуле ДНK тако и остале компоненте реакционе смеше, до тачно одређених температура током целе реакције. Како би се избегло испаравање раствора, загрејани поклопац се ставља на врх туба. Ове машине у САД-у коштају око $ 2,500 (2004).

[уреди] Кораци реакције

PCR реакција се састоји од серије од двадесет, тридесет па и четрдесет циклуса. Сваки циклус се састоји од три корака:

1. ДНК молекул се прво загреје до 94-96°С како би се два ланца која су претходно спојена водоничним везама раздвојили. Овај корак се назива денатуризација, и кида водоничне везе. Овај корак траје обично од једног до два минута.
2. Када се ланци ДНК молекула раздвоје, температура се снизи како би се прајмери самостално навезали на оба раздвојена ланца. Температура зависи од врсте прајмера, дужине и нуклеотидног састава, и обично је око 5°С испод њихове тачке топљења (45-60°С). Погрешна температура у овом кораку може да доведе до тога да се прајмери уопште не закаче на ДНК ланце или се надовежу на погрешном месту. Овај корак такође траје од једног до два минута.
3. И на крају, ДНК полимераза мора да попуни празнине на ланцима, тако што почне од почетног прајмера и иде дуж целог ДНК молекула. Овај корак се назива елонгација. Температура елонгације зависи од ензима ДНК полимеразе који се употребљава. Време трајања овог корака зависи од ензима који се користи као и дужине ДНК фрагмента који се копира.

[уреди] Литература

• Molecular cloning [A lab manual] Sambrook and Russell, 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2001.
• Mullis, Kary, Dancing in the Minefield, ISBN 0679774009.

[уреди] Референце