PCR quantitative
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Il existe diverses techniques permettant de quantifier l'ADN en biologie moléculaire. On peut utiliser la spectromètrie à 260 nm. Une autre technique fiable permettant la quantification de l'expression d'un gène est le Southern blot. Cette technique a été développée historiquement en utilisant la radioactivité. Ceci suppose des temps d'exposition des films radiographiques et alourdit la manip.
La PCR permet de mesurer de manière quantitative le nombre de brin d'ADN initial contenant l'amplicon.
Sommaire |
[modifier] Historique
[modifier] En PCR en point final
Beaucoup de personnes s'affranchissent de mettre en oeuvre les techniques du southern blot et quantifie à l'aide de la technique de la PCR en point final. Cette quantification est faite selon le postulat que plus il y avait d'ADN au départ, plus il y en a à l'arrivée, à la fin des 40 cycles d'amplification. On quantifie ensuite grossièrement à la lecture des gels d'agarose, grâce à la comparaison des intensités des bandes obtenues avec celles d'un marqueur de poids moléculaire. L'oeil humain ne permettant pas de discriminer de façon absolue les différences d'intensité entre les bandes, on peut avoir recours à un logiciel de d'analyse d'images, tel ImageJ. Cependant, la précision gagnée dans la lecture de l'intensité de la bande peut-être compensée par une perte de précision du au côté arbitraire du placement de la ligne de base et la présence d'un bruit de fond non-homogène sur l'image.
[modifier] La PCR semi-quantitative
[modifier] La PCR compétitive
[modifier] En PCR en temps réel
Lors de la PCR en temps réel, lorsque l'on veut quantifier, il faut toujours faire des échantillons de dilution croissante connue pour obtenir une courbe étalon de concentration, avec l'ADN du gène recherché. Le programme de la machine de PCR en temps réel calcule l'éfficacité E de la réaction.
[modifier] Quantification absolue
Durant la partie de la courbe en sigmoïde de l'échantillon, après la ligne de seuil de détection, au moment où l'amplification est exponentielle, on a :
Qn = Qo.En (1)
où :
Q est la quantité d'ADN
n est l'indice du nième cycle
0 est l'indice du cycle de départ
E est l'efficacité de la réaction
donc au cycle de seuil (ct ou threshold cycle), premier cycle au dessus de la ligne de base :
[modifier] Quantification relative
On établit un rapport R entre la quantité d'ADN de départ d'un échantillon et celle d'un témoin, qui n'a pas subit de traitement. Au seuil de détection, on a :
de (1), on déduit donc :
Soit :
ou : R = EΔct
[modifier] Quantification relative corrigée par un gène de référence
Le gène de référence est un gène qui n'est pas induit par le traitement que l'on fait subir pour mesurer la variation du gène cible. Effectuer une correction à partir d'un gène de référence permet d'éliminer les effets de fluctuations.
