Replicazione del DNA
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La replicazione è il meccanismo molecolare attraverso cui il DNA produce una copia di sé stesso. Ogni volta che una cellula si divide, infatti, l'intero genoma deve essere duplicato per poter essere trasmesso alla progenie (tramite mitosi o meiosi). Il meccanismo della replicazione è complesso e richiede l'intervento di numerosi enzimi e di proteine iniziatrici. Il processo di replicazione del DNA si definisce semiconservativo: il doppio filamento di DNA parentale funge da stampo per la sintesi di due filamenti figli complementari.
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[modifica] DNA Polimerasi
L'enzima basilare della replicazione è la DNA polimerasi, che catalizza il legame di deossiribonucleotidi trifosfato (dNTP)
[modifica] Polimerasi nei Procarioti
I Procarioti possiedono cinque tipi di DNA Polimerasi:
- DNA Polimerasi I: implicata nella riparazione del DNA e nella rimozione degli inneschi dei frammenti di Okazaki. Possiede attività esonucleasica sia in direzione 5'->3', sia in direzione 3'->5'
- DNA Polimerasi II: indotta da danni al DNA per riparazione incline all'errore (error-prone). Ha attività polimerasica 5'->3' ed esonucleasica 3'->5'
- DNA polimerasi III: l'enzima principale per la replicazione, con attività polimerasica 5'->3' ed esonucleasica (nella correzione di bozze, o proofreading) 3'->5'. Attiva sia nella sintesi del filamento leading, sia in quella dei frammenti di Okazaki.
- DNA Polimerasi IV-V: anch'esse coinvolte nella riparazione incline all'errore
[modifica] Polimerasi negli Eucarioti
Le Polimerasi degli Eucarioti sono costituite invece da:
- DNA Polimerasi α: è una primasi (enzima che sintetizza i primer di RNA) e procede inoltre all'allungamento dei primer con alcune centinaia di deossiribonucleotidi.
- DNA Polimerasi β: coinvolta nella riparazione del DNA
- DNA Polimerasi γ: replica il DNA mitocondriale
- DNA Polimerasi δ: l'enzima principale della replicazione eucariotica. Sintetizza sia il filamento leading, sia il filamento lagging. Riempie inoltre le interruzioni tra i frammenti di Okazaki.
- DNA Polimerasi ε: stessa funzione della Polimerasi δ.
[modifica] Il meccanismo della replicazione
Un filamento di DNA, detto filamento leading (filamento guidA), viene sintetizzato in modo continuo; l'altro, detto filamento lagging (filamento lento), è dapprima formato da corti frammenti di DNA (i frammenti di Okazaki) di 1-3 kilobasi. In seguito i frammenti sono uniti dall'enzima DNA ligasi.
La sintesi di DNA non può iniziare ex novo, quindi l'enzima primasi sintetizza corti inneschi di RNA complementari al DNA stampo. Nei procarioti gli inneschi dei frammenti di Okazaki sono rimossi dall'enzima RNasi H e dalla Polimerasi I. Negli Eucarioti altri enzimi rimuovono i primer e la Polimerasi δ riempie le interruzioni tra i frammenti.
Le DNA Polimerasi, affinché il processo di replicazione sia efficace, necessitano di proteine che aumentino la loro attività e le stabilizzino sul filamento. Le clamp-loading legano il DNA alla giunzione tra l'innesco e lo stampo, le sliding-clamp si congiungono a queste ultime, caricano la Polimerasi sul DNA e garantiscono la sua stabilità.
Lo svolgimento del DNA parentale è catalizzato dall'enzima elicasi, che denatura il filamento sfruttando l'idrolisi dell'ATP. Proteine che si legano al DNA a singolo filamento stabilizzano il DNA denaturato in modo che la Polimerasi possa scorrervi.
Per evitare che i filamenti si attorciglino le topoisomerasi introducono tagli singoli (nel caso delle Topoisomerasi I) o doppi (nel caso delle Topoisomerasi II). Queste rotture reversibili fungono da perni, che consentono al DNA di ruotare liberamente.
La replicazione inizia in corrispondenza di una specifica sequenza chiamata origine di replicazione, che costituisce un sito di legame per proteine iniziatrici. Una proteina si lega all'origine e inizia a svolgere il DNA; recluta in seguito altre proteine e, insieme a esse e all'elicasi, continua la denaturazione. Le primasi inizia la sintesi dei primer. La regione in cui i filamenti parentali si separano e i due nuovi filamenti si allungano è denominata forca replicativa. Nei Procarioti, il cui DNA è generalmente circolare, sono presenti due forche replicative che dipartono dalla medesima origine. Quando le due forche si incontrano la replicazione è terminata.
I genomi eucariotici sono spesso assai più grandi di quelli procariotici e necessitano di origini multiple. Da ogni origine di replicazione nasce una bolla replicativa che si espande in direzioni opposte. Due bolle replicative entrate in contatto si fondono formandone una sola.
