Трансформація (генетика)

Матеріал з Вікіпедії — вільної енциклопедії.

Трансформація — генетична модіфікація клітини шляхом введення і експресії інородного генетичного матеріалу (ДНК).

Зараз це загальна лабораторна процедура в молекулярнії біологіії. У 1944 році ефект був вперше продемонстрований Освальдом Авері, Коліном Маклеодом і Макліном Маккарті, які провели передачу гена до бактерії Streptococcus pneumoniae. Авері, Маклеод і Маккарті назвали таке введення і експресію ДНК трансформацією бактерій. Зараз цей термін використовується для описання процесу передачі ДНК до нових клітин в молекулярній біології і встроювання її до геному (що відрізняє її від трансфекції — передачі ДНК баз встроювання). Наприклад виробництво трансгенних рослин вимагає вставки нової генетичної інформації в геном рослини, використовуючи відповідний механізм передачі ДНК. Молекули РНК також можуть переноситися до клітин такими ж методами, але це звичайно не проводить до спадкових змін і тому не розглядається як трансформація.

[ред.] Історія відкриття

• 1928 — Фредерік Гріффіт перетворює непатогенних бактерій Pneumococcus в патогенних змішуучи їх із вбитими патогенними бактеріями.
• 1944 — Освальд Авері, Колін Маклеод і Маклін Маккарті виявляють, що перетворюючим фактором є ДНК і називають процес трансформацією.

[ред.] Механізми

[ред.] Бактерії

В бактеріях для опису процесів трансформації використовується термін компетентність — стан, коли бактерії мають можливість приймати ДНК із зовнішнього середовища. Існують дві форми компетентності, природна і штучна.

[ред.] Природна компетентність

Бактерії багатьох видів (можливо, більшості) природно здібні до прийняття ДНК. Такі види несуть набори генів, що кодують білкові комплекси для забезпечення перенесення ДНК через клітинну мембрану (або мембрани). Еволюційна функція цих генів спірна. Хоча більшість підручників і дослідників припускають, що клітини приймають ДНК, щоб придбати нові версії генів, простішим поясненням, яке відповідає більшісті спостережень, є те, що клітини приймають ДНК переважно як джерело нуклаотидів, які можуть використовуватися безпосередньо або бути розбитими і використовуватися для інших цілей. Частіше за все бактерії, що природно піддаються трансформації, експресують свої гени компетентності тільки за специфічними умовами, часто у відповідь на харчовий тиск. Як тільки ДНК входить до цитоплазми клітини, вона часто розрізається клітинними нуклеазами, або, якщо ця ДНК дуже подібна до власної ДНК клітини, ферменти, що звичайно ремонтують ДНК, можуть рекомбінувати її з хромосомою. Природна трансформація ефктивна у випадку лінійної ДНК, але не кругової ДНК плазмід.

[ред.] Штучна компетентність

Штучна компетентність не кодується в генах клітин. Натомість, вона викликається лабораторними процедурами, в яких клітини пасивно робляться проникними для ДНК, використовуючи умови, які зазвичай не зустрічаються в природі. Ці процедури порівняно легкі і прості, і широко використовуються в молекулярній біології і генній інженерії бактерій. Штучно компетентні клітини стандартних бактеріальних штамів навіть виробляються комерційно і можуть бути купленими замерзлими і готовими для використання.

Охолодження клітин при наявності двовалентних катіонів, наприклад Ca²⁺ (у CaCl₂), робить клітинні мембрани більш проникними до плізмідної ДНК. Осередки культивуються з ДНК, а потім раптово нагріваються (до 42 °C протягом 30-60 секунд), що примушує ДНК до проникнення до клітини. Цей метод добре працює для кругової ДНК рлазмід, але не для лінійних фрагментів хромосомної ДНК. Хороша підготовка компетентних клітин надасть біля 10⁸ випадків трансформації на мкг ДНК плазміди. Погана підготовка дасть близько 10⁴ / мкг або менше. Хороші непромислові підготовки повинні надати 10⁵-10⁶ трансформацій на мкг ДНК плазміди.

Електропорація — інший спосіб створення отворів в клітинах, раптово шокуючи їх з електричним током з напругою 100—200 В/мм. Плазмадна ДНК може увійто до клітини через ці отвори. Природні механізми ремонту мембрани згодим закривають ці отвори.

Плазміди містять послідовності, що дозволяють їм реплікуватися у клітині незалежно від хромосоми. Плазміди, що використовуваються в експериментах, зазвичай також міститимуть ген антибіотичного опору, який розміщується в бактерійному штамі, що не має антибіотичного опору до певного антибіотику (так звана селекція). Тому, тільки трансіормовані бактерії можуть вижити на середовищі з цим антибіотиком (селективному середовищі). Наприклад, плазміда, що кодує білок ß-лактамазу (тобто містить bla-ген), робить бактерій стійкими до ампіциліну. Бактерії потім вирохуються на середовищі з ампіциліном, вбиваючи бактерій, які не прийняли bla-ген.

Інший засіб виділення клітин, що пройшли трансформіцію, — скрінінг, тобто використання генів, що роблять трансформованих бактерій візуально відмінними. Наприклад, для цього використовується галактозідазний тест та експресія флюоресцентних білків, таких як GFP.

У випадку бактерій, термін «трансформація» звичайно не використовується, якщо генетичні зміни були визвані процесами трансдукції або кон'югації, при яких передача ДНК здійснюється за допомогою бактеріофагів та кон'югаторних плазмід відповідно.

[ред.] Дріжджі та інші гриби

Відомо кілька методів трансформації дріжджів:

• Високоефективна трансформація (High Efficiency Transformation) згідно Gietz, R. D. and R. A. Woods. 2002 TRANSFORMATION OF YEAST BY THE Liac/SS CARRIER DNA/PEG METHOD. Methods in Enzymology 350: 87-96.
• Дво-гібридний протокол (Two-hybrid System Protocol): Дво-гібридна система залучає використання двох різних плазмід в єдиній клітині дріжджів. Одна плазміда містить ген або послідовність ДНК зо повинні бути внесені до клітин, а інша плазміда містить бібліотеку генома або кДНК (cDNA) [1].
• Швидкий протокол трансформації (Rapid Transformation Protocol) — див. посилання на статтю Gietz/Wood вище.
• Протокол замерзлих дріжджів (Frozen Yeast Protocol) дозволяє приготування замерзлі клітин дріжджів, компетентних для трансформації після розморожування.
• Генетична гармата (Gene Gun Transformation) — бомбордування клітин золотими або вольфрамовими частинками покритими ДНК переносить ДНК до клітин.
• Протопластна трансформація (Protoplast Transformation) — грибні спори можуть бути перетворені на протопласти, який можуть прийнімати ДНК із розчину і трансформуватися.

[ред.] Рослини

Рослина (S. chacoense) трансформовані використовуючи Agrobacterium. Трансформовані клітини формують характерні нарости на шматках листя

Доступні механізми перенесення ДНК до рослинних організмів включають:

• Трансформація за допомогою Agrobacterium є найлегшим методом трансформації рослин. Рослинна тканина (найчастіше, листя) нарізається на маленькі шматки, (біля 10x10 мм) і поміщається на 10 хвилин в рідину, що містить Agrobacterium. Деякі клітини уздовж розрізу трансформуються бактерією, яка вставляє свою ДНК в клітину. Потім рослини знову вирощуються на селективному середовищі. Деякі види рослин можуть бути трансформовані тільки зараженням квіток Agrobacteria, а потім висіванням насіння в селективному середовищі. На жаль, багато рослин непіддатливі трансформації цим методом.

• Генетична гармата: Маленькі золоті або вольфрамові частинки покриваються ДНК і вистрілювабться в молоді рослинні клітини або ембріони. Деякий генетичний матеріал залишиться в клітинах і трансформує їх. Цей метод також дозволяє трансформацію рослинних пластид. Ефективність трансформації нижче, ніж при трансформації за допомогою Agrobacterium, але більшість рослин можуть бути трансформовані цим методом.
• Електропорація: як і з бактеріями, отвори в клітинах рослин робляться, використовуючи електричний ток.
• Вірусна трансформація: Генетичний матеріал упаковується у відповідному рослинному вірусі, а потім змінений вірус використовується для інфекції рослини. Геноми більшості рослинних вірусів складаються з одно-ланцюжкової РНК, який реплікується в цитоплазмі зараженої клітини. Так цей метод є трансфекцією, а не реальною трансформацією, тому що вставлені гени ніколи не досягають ядра клітини і не об'єднують з його геномом. Нащадки заражених рослин вільні від вірусу та від вставленого гена.

[ред.] Тварини

• Мікроін'єкція: використання дуже тонкої голки для ін'єкції ДНК безпосередньо в ядро ембріональних клітин.
• Вірусне перетворення: Аналогічно випадку з рослинами, генетичний матеріал упаковується у вірусі, який доставляє його до кклітини. На відміну від рослин, у тварин цей метод часто приводить до дійсної тансформації.

[ред.] Ресурси Інтернет

• Bacterial Transformation (Флаш-анімація)
• Precision genetic engineering Встроювання нових генів до рослинних клітин — нові методи