Patch-Clamp-Technik

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Die Patch-Clamp-Technik, eine Methode der Elektrophysiologie, wurde 1976 von Erwin Neher und Bert Sakmann entwickelt. Für diese Arbeit erhielten sie 1991 den Nobelpreis für Medizin und Physiologie. Die Erforschung der Ionenströme und anderer elektrischer Phänomene an Zellmembranen wurde durch diese Technik revolutioniert. Die Patch-Clamp-Technik wird in verschiedenen Konfigurationen angewendet.

Patch-Clamp-Anordnung

Zunächst wird eine dünn ausgezogene und mit Lösung gefüllte Glaskapillare, die sogenannten Patch-Clamp-Pipette (Durchmesser an der Spitze ca. 1 µm) vorsichtig auf eine intakte Zelle gedrückt. Unterhalb der Pipette, innerhalb des Durchmessers der Spitze, befindet sich ein Stück Membran – der Patch oder Membranfleck (engl. patch – Fleck). Anschließend wird durch leichten Unterdruck, der am hinteren Ende der Pipette angelegt wird, eine starke Verbindung (Versiegelung) zwischen Membran und Pipette erzeugt. Zwischen dem Inneren der Pipette und der Außenlösung entsteht dadurch ein elektrischer Widerstand in der Größenordnung von mehreren Giga ohm, der sogenannte "Gigaseal" (engl. to seal – versiegeln). Mit der Herstellung des Gigaseals ist die sogenannte Cell-Attached-Konfiguration der Patch-Clamp-Technik erreicht (engl. to attach – anheften, befestigen an, festmachen an). Durch den hohen Widerstand des Gigaseals muss ein Strom, der durch einen innerhalb des Patches liegenden Ionenkanal fließt, auch durch den Pipetteninhalt fließen. In die Pipettenlösung taucht eine Elektrode, die an einen empfindlichen Verstärker angeschlossen ist. Dadurch ist es möglich, die Aktivität eines einzelnen Ionenkanals in der Membran des Patches zu messen. Sowohl die Zellmembran, deren Bestandteil der Patch ist, als auch das Innere der Zelle bleiben in dieser Konfiguration intakt.

Durch weiteres Anlegen von Unterdruck am Ende der Pipette oder kurze Pulse elektrischer Spannung an der Elektrode in der Pipette kann der Patch geöffnet werden, während der Gigaseal intakt bleibt. Zwischen dem Inneren der Pipette und dem Inneren der Zelle besteht nun eine Kontinuität, während beide gegen die Außenlösung durch den hohen Widerstand des Gigaseals isoliert sind. Diese Konfiguration der Patch-Clamp-Technik wird als Whole-Cell-Konfiguration bezeichnet (engl. whole cell – ganze Zelle). In dieser Konfiguration wird von der gesamten Zellmembran abgeleitet. Da die Pipettenlösung das Innere der Zelle füllt, muss sie in ihrer Zusammensetzung dem Cytosol ähnlich sein. Gleichzeitig bietet diese Konfiguration die Möglichkeit, über die Pipettenlösung die Zelle von innen her zu manipulieren.

Wenn nach Erreichen der Cell-Attached-Konfiguration der Patch nicht geöffnet wird, sondern die Pipette sanft von der Zelle abgezogen wird, löst sich der unter der Pipettenspitze befindliche Teil der Membran von der Zelle und verbleibt an der Pipette. Dabei weist die vormals innere Seite dieses Membranstücks nun nach außen in die Badlösung, während die vormals äußere Seite des Membranstücks sich im Inneren der Pipette befindet. Das ist die sogenannte Inside-Out-Konfiguration. Ähnlich wie die Cell-Attached-Konfiguration ermöglicht sie die Messung einzelner Ionenkanäle im Membranstück an der Pipettenspitze. Im Unterschied zu dieser jedoch kann in der Inside-Out-Konfiguration das Milieu an der Innenseite der Membran manipuliert werden. Füllt man die Pipette mit einer Lösung, die das extrazelluläre Milieu simuliert, kann man das Verhalten der Ionenkanäle in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des Cytosols untersuchen.

Es ist mit diesem Verfahren sogar möglich, die Funktion von Zellen in ihrer natürlichen Umgebung im lebenden Organismus (in vivo) zu messen.

[Bearbeiten] Planar patch clamp

Planares patch clamp ist eine neue Methode, die entwickelt wurde, um den Durchsatz in der Elektrophysiologie zu erhöhen. Anstatt eine Pipette auf eine adhärente Zelle zu positionieren, wird Zell-Suspension auf einen Chip pipettiert, in den eine mikrostrukturierte Apertur eingebracht wurde.

Schematischer Aufbau eines klassischen Patch Clamp Experiments. Die Pipette wird mit Hilfe eines Mikromanipulators unter optischer Kontrolle auf eine adhärente Zelle positioniert. Relativbewegungen zwischen Zelle und Pipette müssen vermieden werden, um die Zell-Pipetten Verbindung intakt zu erhalten.

Beim planaren Patchen wird die Zelle durch Unterdruck auf ein Loch positioniert - Relativbewegungen zwischen Zelle und Loch können ausgeschlossen werden. Ein schwingungsgedämpfter Tisch oder ein Mikroskop sind nicht nötig.

Eine einzelne Zelle wird dann mit Unterdruck auf das Loch gesaugt und eine elektrisch dichte Verbindung zwischen Zelle und Glas ausgebildet (Gigaseal). Die Planare Geometrie bietet verglichen mit dem herkömmlichen Patch-Clamp-Verfahren einige Vorteile:

Die Integration von mikrofluidischen Kanälen erlaubt automatisierte Wirkstoffzugabe, wie sie in der Pharmaforschung benötigt wird.
Das System ist für optische und rastersondenmikroskopische Verfahren zugänglich.
Die Perfusion der Intrazellulärseite ist sehr viel einfacher möglich, wodurch Wirkstoffe besser untersucht werden können, die intrazellulär wirken.
Für die Durchführung der Messungen ist keine spezielle Ausbildung nötig.
Nicht-adhärente Zellen (wie rote Blutkörperchen), die sich klassisch nur sehr schwer untersuchen lassen, sind planar sehr viel einfacher zu patchen.
Die Messaufbauten können miniaturisiert werden:

Während ein klassischer Aufbau leicht einen halben Laborraum ausfüllen kann (links), lässt sich ein planarer Aufbau auch als Tischgerät realisieren (rechts: eines der ersten Geräte.

Den Vorteilen stehen einige Nachteile gegenüber:

Zellen wie Neuronen oder Makrophagen haften fest an der Oberfläche, auf der sie kuliviert wurden. Bei der enzymatischen Ablösung muss sichergestellt werden, dass die Proteasen die Kanalproteine auf der Zelloberfläche nicht beeinträchtigen. Adhärente Zellen können also nicht unter streng physiologischen Bedingungen gepatcht werden. Die weiteste Verbreitung haben Planar-Patch-Systeme daher bei transfizierten Zellkulturen.
Da die Zellen vereinzelt werden müssen, sind keine Messungen an Gewebeschnitten möglich.
Es muss sichergestellt werden, dass die Zellsuspension homogen ist, da die gepatchte Zelle aus dem Ensemble "blind" ausgesucht wird. Die Zelle kann also nicht anhand ihrer Form oder eines fluoreszierenden Labels ausgesucht werden.
Trotz der weitgehenden Miniaturisierung liegen die Anschaffungskosten pro Messkanal in einem ähnlichen Bereich wie beim konventionellen Patch Clamp. Hochparallele Systeme lohnen sich daher erst bei entsprechend hohen Durchgangszahlen.