PBR322
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Das Plasmid pBR322 wurde 1977 von Francisco Bolivar und Raymond Rodriguez konstruiert und war eines der ersten künstlich hergestellten Plasmide.[1] Es ist ein Derivat eines R-Plasmids, das einen Replikationsursprung oriV (origin of vegetative replication), Gene für Ampicillin-Resistenz und Tetracyclin-Resistenz auf sich trägt. Im Unterschied zu gewöhnlichen R-Plasmiden fehlt ihm die Fähigkeit, sich auf andere Zellen selbstständig zu übertragen (tra-Gene, oriT). Es war ein vielbenutzter Vektor; heute benutzt man allerdings fortschrittlichere, einfacher zu handhabende Vektoren.
Inhaltsverzeichnis |
[Bearbeiten] Name
Der Name des Plamids pBR322 setzt sich wie folgt zusammen:
- p steht für Plasmid,
- B und R stehen für die Namen der Hersteller des Plasmids (F. Bolivar & R.L. Rodriguez),
- 322 ist eine Labornummer, um ähnliche, aber nicht identische Plasmide unterscheiden zu können.
[Bearbeiten] Konstruktion
Das Plasmid pBR322 wurde aus folgenden DNA-Elementen konstruiert:
- einem Ampicillin-Resistenzgen aus Tn3
- einem Tetracyclin-Resistenzgen aus pSC101
- einem DNA-Replikationsursprung (oriV) aus pMB1
Das konstruierte Plasmid besteht aus 4361 Basenpaaren.[2]
[Bearbeiten] Verwendung
Wesentlich für das Arbeiten mit dem Plasmid als Vektor sind die zahlreich vorhandenen Restriktionsendonuclease-Schnittstellen. Werden Restriktionsenzyme eines bestimmten Typs zugefügt, schneiden diese das Plasmid an den spezifischen Schnittstellen auf und erzeugen ein linearisierte Plasmid mit sogenannten "sticky ends". Diese entstehen durch die Tatsache, dass Restriktionsendonucleasen eines gewissen Typs die Basen nicht glatt schneiden, sondern versetzt. Die einzubauende Fremd-DNA wird mit dem gleichen Enzym geschnitten, so dass die Enden zusammenpassen. Da die "sticky ends" komplementär sind, kann sich das Plasmid entweder wieder zu einem zirkulären Plasmid ohne Integration zusammenfügen oder die komplementären Stücke der Fremd-DNA einbauen und somit, falls die Schnittstelle in einem der Resistenzgene war, die Expression dieses Gens unterbrechen. Wird z. B. beim pBR322 mit SalI geschnitten, so würde bei Integration von Fremd-DNA die Zelle aufgrund des deletierten Tetracyclinresistenzgens auf Tetracyclinmedium sensibel reagieren und absterben.
Zur Selektion der gewünschten Zellen wird die Bakterienkultur zuerst auf einem Nährboden ausgestrichen, der das Antibiotikum Ampicillin enthält, um nur jene Bakterien zu erhalten, die das Plasmid durch Transformation erhalten haben. Danach wird ein Abdruck gemacht, der mit Tetracyclin behandelt wird. An den Stellen, an denen die Kulturen sterben, sind also offensichtlich Kulturen vorhanden, die eine Tetracyclin-Sensibilität enthalten, was auf das Einfügen von Fremd-DNA zurückzuführen ist.
[Bearbeiten] Quellenangaben
- ↑ F. Bolivar, R.L. Rodriguez, P.J. Greene, M.C. Betlach, H.L. Heyneker, H.W. Boyer (1977): Construction and characterization of new cloning vehicles. In: Gene. Bd. 2, Nr. 2, S. 95-113. PMID 344137
- ↑ N. Watson (1988): A new revision of the sequence of plasmid pBR322. In: Gene. Bd. 70, Nr. 2, S. 399-403. PMID 3063608
