Diskussion:Polymerase-Kettenreaktion

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Hallo, ich bin zum ersten mal hier in wikipedia aktiv und weiss nicht, ob das der richtige weg ist, wenn einem etwas nicht ganz stimmig in einem artikel erscheint, schreibe es aber einfach trotzdem mal hier rein:

In der Abbildung zur Polymerase-Kettenreaktion ist ein Schritt 4 dargestellt, der den Eindruck vermittelt, dass sich am Ende des ersten Zyklus die ursprünglichen Matrizenstränge von den neu synthetiesierten (einseitig terminierten) Nukleinsäuresträngene trennen und sich jeweils die alten Matrizenstränge wieder zusammenlagern sowie die neu synthetisierten Stränge hybridisieren. Das ist falsch.

Im übrigen finde ich den Artikel prima ! Viele Grüße, Dagmar

[Bearbeiten] Anwendungen in eigene Artikel

Mein Vorschlag wäre, die einzelnen Anwendungen auszulagern. Für die meisten gibt es sowieso schon eigene Artikel, wo die Methodik noch einmal beschrieben wird. Hier könnten sie deshalb nur kurz (in einem Satz) dargestellt und verlinkt werden. --Nina 13:04, 27. Jan 2005 (CET)

[Bearbeiten] Gliederung

Die Abschnitte "Ablauf", "Beispiel" und "Schritte des PCR-Prozesses" sind teilweise redundant, zumindest aber sehr schlecht aufeinander abgestimmt und wenig zielführend. Der Abschnitt "PCR in der Praxis" wirkt verfehlt, ohne einen Abschnitt "PCR in der Theorie" macht der Titel auch nicht viel Sinn. Dahingegen fehlt bei Ablauf das wesentliche an der PCR, nämlich weshalb letztendlich mithilfe von zwei Primern eine ganz bestimmte Sequenz abgelesen werden kann, obwohl doch die Polymerase immer ganze Stränge abarbeitet und lediglich bei einem Primer anfängt. Die Abbildung zeigt das ja teilweise, nur der Text lässt diese Frage offen. --Saperaud ☺ 02:44, 28. Nov 2005 (CET)

nein ich finde die gliederung sehr gut, jedoch würde ich gerne wissen wieso die DNA-Polymerase bei 70°C sich anlagert. sobald doch die einzelstränge vorliegen und die primer daran gebunden sind kann doch die Polymerase anfangen zu arbeiten. ist es aufgrund dessen, dass die reaktion schlicht weg schneller von statten geht (RGT-Regel...).ich bitte um aufklärúng ;) danke schon mal. PS der artikel ist wirklich super + hoffentlich habe ich es nicht überlesen ;) mfg MauZi

[Bearbeiten] Geschichte

Ist nicht schlüssig. (1.)Zuerst wird erzählt, dass Mullis orinär "Taq" verwendet hätte, (2.)dann, dass er noch "keine stabile Polymerase" hatte und das Verfahren ineffektiv gewesen sei, (3.)dann, daß man heute von thermophilen Bakterien das Enzym nimmt, dass deshalb "Taq" heissen würde. Was denn nun wirklich in welcher Reihenfolge? --Wikipit 11:48, 4. Jan 2006 (CET)

[Bearbeiten] Kritik an der Definition

Ohne lebende Organismen, sicher irgendwie. Nur die Enzyme werden genau lebenden Organismen entnommen oder werden sie synthetisiert? Kann man das präziser fassen? --Wikipit 12:02, 4. Jan 2006 (CET)

richtig lesen freund ;) ist ja klar, dass das ausgangsmaterial aus zellen entnommen werden müssen. es wird jedoch die ganze praxis OHNE hilfe von bakterien in lustigen reagenzgläsern durchgeführt. halt eben nicht in vivo ;) und das ausgangsmaterial braucht man nur in geringen mengen, da es ja eben mit diesen verfahren repliziert wird. nicht so zwanghaft fehler suchen^^ hoffe ich habe dich nicht falsch verstanden mfg MauZi

Dann soll der Verfasser schreiben: "in vitro" ! --Wikipit 09:00, 5. Jan 2006 (CET)

[Bearbeiten] Mangelhafte Lokalisierung

Eine hochwertige Enzyklopädie sollte sprachlich weitgehend lokalisiert sein. Die häufige Verwendung der engl. Abkürzung DNA (an Stelle von DNS) erscheint mir doch etwas gedankenlos. Sie gehört in die englische Fassung der Seite, die per Mausklick erreichbar ist. --Ribald 23:39, 4. Jan 2006 (CET)

Der Begriff DNA ist auch in der deutschen Wissenschaft gebrächlich. Die Verwendung englischsprachiger Begriffe bei jüngeren Erkenntnissen ist üblich. Allein die ABkürzung für die Polymerase-Kettenreaktion mit PCR und nicht PKR spricht dafür.

[Bearbeiten] Korrekturvorschlag zum Beispiel

Kleiner Hinweis: Man setzt für die PCR doch Desoxyribonukleotide ein, also dATP, dTTP, dGTP, dCTP. Bei den angegebenen Nukleotiden besteht die Gefahr der Verwechslung mit Ribobasen. Es gibt zwar Enzyme, die die ATP, GTP, UTP und CTP bei der PCR einbauen. Das ist aber nicht die Regel sondern ein seltener Spezialfall. --Maddy1971 23:42, 4.1.2006

[Bearbeiten] Fehler in Artikel

Die Aussage das der gewünschte DNA Abschnitt in jedem Zyklus verdoppelt wird ist falsch! In den ersten beiden Zyklen erhalten wir nämlich ausschließlich Reaktionsprodukte die länger sind als der gewünschte Abschnitt.

->Das passiert auch in jedem folgendem Zyklus der PCR auch weiterhin! Ausserdem wird die Menge des Produktes nicht pro Zyklus genau verdoppelt, da die Amplifikationseffizienz selten 100% beträgt (gute Reaktionen liegen zwischen 90 und 100% also bei Amplifikationseffizienzen zwischen 1,9 und 2)! Ich finde aber, dass solche Kleinigkeiten dasVerständnis des Artikels erschweren würden! JBrain 12:44, 11. Jan 2006 (CET)

Meines Wissens ist für die Anlagerung der neue Nucleotide die Taq Polymerase verantwortlich

Habe diesen Fehler korrigiert allerdings nicht die im Text verwendeten Termini gebraucht. Das sollte noch verbessert werden.

[Bearbeiten] Ergaenzungsvorschlaege

Im Abbild des Abschnittes "Ablauf" wuerde ich empfehlen, ganz unten bei der Benennung der einzelnen Ablaeufe, in klammern hinterzuschreiben, wie die eigentlichen Fachbegriffe lauten.

also unter

          1 Schmelzen (Denaturierung)
          2 Anlagerung(Hybritisierung)
          3 Verlaengerung (Polymerisation)

und dass es sich bei der PCR-Methode um eine exponentielle Amplifizierung handelt, sollte meines Erachtens auch noch hervorgehoben werden werden... nur um das ewige Suchen nach der richtigen Terminologie der internetfaehigen Welt zu erleichtern...

Ich wiuerde es ja auch liebend gern selbst erledigen, allerdings verhindert mir dies die Editierungssperre..schade

herzlichen Gruß mic.user 22:01 , Feb 2006 (GMT+1)

Deine Vorschläge habe ich umgesetzt -- danke! Ich weiß allerdings nicht wo man am besten exponentielle Amplifizierung unterbringt.

Leider ist der Artikel halb-gesperrrt wie du es sagtest, finde ich sehr schade und ungerechtfertigt. Mal schaun was man da machen kann (infos hier: Wikipedia:Entsperrwünsche)

Gruß --Saibo (Δ) 21:12, 7. Mär 2006 (CET)

Update: Artikel ist entsperrt! --Saibo (Δ) 10:15, 9. Mär 2006 (CET)

[Bearbeiten] Thermophile Organismen

Später wurde der PCR-Prozess verbessert, indem man die DNA-Polymerase von thermophilen Bakterien verwendete, die z.B. bei über 110 °C in Geysiren leben... Glaube, dass die keine 110°C aushalten! Meines Wissens ist die Grenze im Moment bei paarundneunzig °C bei Thermotoga spec. (bin aber kein Fachmann und lasse mich gerne eines Besseren belehren). Die Gattungen Thermus und Pyrococcus liegen knapp darunter. Die Proteine dieser Organismen sind z.T. bis über 110°C stabil (anderer AS Bias, immobilisierte Termini, stabiler faltende Cores, viele Chaperone etc.), unter diesen Bedingungen können die Organismen selber aber nicht überleben! Ausserdem kommen die nicht nur an Geysiren vor, sondern vor allem an Fumarolen wie z.B. Black smoker an MORs (Mittelozeanischen Rücken). Wäre nett, wenn das jemand der sich damit gut auskennt verbessern würde!--JBrain 11:31, 8. Mär 2006 (CET)

[Bearbeiten] Genauigkeit

Wie hoch ist die statistische Genauigkeit der verwendeten Verfahren? 217.191.237.57 16:35, 24. Mär 2006 (CET)

Könntest Du diese Frage vielleicht etwas Präzisieren? Geht es um die Auswertung bei Vaterschaftstests oder gen. Fingerabdrücken oder um die PCR selber? Die verwendeten Enzyme machen ab und zu mal einen Fehler (Häufigkeit abhängig von den Reaktionsbedingungen und davon, ob sie eine 3'-5' Exonucleaseaktivität besitzen, auch 'Proofreading' genannt). Insgesamt aber ist es eine sehr genaue und sichere Methode! In der Phorensik ist die statistische Genauigkeit der Aussage (aus den Experimenten) meist nicht ein Problem der PCR selber, also der verwendeten Methode, sondern eher eine Verteilung der analysierten Marker in der Population! Die statistische Aussagekraft hängt also dabei von dem genauen Wissen über die Häufigkeit und Verteilung der einzelnen Marker in der menschlichen Population ab, nicht aber von der PCR selber. Ich hoffe, dass das die Frage einigermaßen beantwortet! Gruß --JBrain 17:05, 24. Mär 2006 (CET)

[Bearbeiten] RNA

Im Artikel kommt der Begriff RNA nicht vor, es heißt eingangs, die PCR tauge zur Analyse der DNA. Nun sind aber Influenzaviren RNA-Viren, und (im Kontext von Influenza A/H5N1) wird immer wieder berichtet, dass deren Genom mit Hilfe der PCR analysiert wird. Im Artikel PCR müsste wohl ein kleiner Absatz stehen, wie das möglich ist: Muss die RNA erst in DNA umgeschrieben werden, oder taugt die PCR auch unmittelbar zur RNA-Analyse. Gruß: --Gerbil 15:26, 11. Apr 2006 (CEST)

Das ist korrekt, RNA wird erst revers transkribiert und dann die PCR durchgeführt. Im Alltag wird das häufig in zwei getrennten Schritten gemacht, empfindlichere Verfahren beeinhalten eine Ein-Topf-Reaktion. Wie auch immer es läuft, das Ganze nennt sich RT-PCR. --Lode 15:53, 11. Apr 2006 (CEST)

[Bearbeiten] PCR in der Praxis

Die eingschränkung der PCR auf Produktgrößen bis 1kb ist falsch. Während meiner Dipl.-Arbeit waren Produktgrößen bis 3kb kein Problem. Auch der aktuelle Beipackzettel der Taq-Polymerase von Roche Applied Science hat 3kb als max. Produktgröße angegeben. In diesem Bereich ist vor allem der Faktor Zeit während der Elongatuion wichtig (ca. 1 min je 1000 basen) Jiver 15:52, 7. Jun 2006 (CEST)

Richtig, und mit speziellen Long-Template-Kits ist noch mehr drin: über 20-40 kbp (z.B. v. Roche). --Jan R 13:17, 8. Jun 2006 (CEST)

[Bearbeiten] Vorschlag für die Verbindung von "Ablauf" und "Schritte des PCR-Prozesses"

Da beide Absätze eindeutig das selbe beschreiben (noch dazu unterschiedliche Angaben machen), halte ich es für sinnvoll, sie zu einem Absatz zu verbinden. Hier ein Vorschlag: Jiver 10:35, 4. Jul 2006 (CEST)

[Bearbeiten] Ablauf des PCR-Prozesses

Im Folgenden werden die einzelnen Schritte der PCR dargestellt. Alle gemachten Angaben sind als Richtwerte zu betrachten, die je nach Anforderung an die PCR angepasst werden müssen.

1. Initialisierung (auch initiale Denaturierung). Das Gemisch wird ca. 2 Minuten lang auf 94-96 °C erhitzt, um sicherzustellen, dass sich die DNA-Doppelstränge getrennt haben. Die Wasserstoffbrückenbindungen, die die beiden DNA-Stränge zusammenhalten, werden aufgebrochen. Bei einer sogenannten “hot start-PCR” muss durch eine längere anfängliche Erhitzungs-Phase (bis zu 15 Minuten) die Polymerase erst freigesetzt bzw. aktiviert werden. Dieser Schritt wird einmalig vor der eigendlichen PCR-Reaktion durchgeführt um sicherzustellen, dass sich die doppelstängige Ausgangs-DNA als auch mögliche Primerdimere getrennt haben und als Einzelstränge vorliegen..
2. Denaturierung (auch Melting, Schmelzen). Die Temperatur ca. 30 Sekunden lang auf 94-96 °C halten. Das genügt gewöhnlich, um die DNA während der Zyklen zu zerlegen.
3. Annealing (auch Anlagerung, Primerhybridisierung). Die Temperatur ca. 30 Sekunden lang auf einer Temperatur halten, die eine spezifische Anlagerung der Primer an die DNA erlaubt. Meist liegt die Temperatur bei 50°C bis 65°C, die genaue Temperatur wird hierbei durch die Länge und die Anzahl komplementärer Nukleotide in der Primersequenz bestimmt (siehe Mutagenese). Wird die Temperatur zu niedrig gewählt, können sich die Primer u. U. auch an nicht 100%-komplementären Sequenzen anlagern und so zu unspezifischen Produkten (Geisterbanden) führen. Wird die Temperatur zu hoch gewählt, ist die thermische Bewegung der Primer u. U. so gross, dass sie sich nicht richtig anheften können, so dass es zu gar keiner oder nur ineffizienter Produktbildung kommt.
4. [Elongation]] (auch Verlängerung, Polymerisation). Die Temperatur wird für ca. 30 Sekunden je 500 Basenpaare auf 68-72 °C (je nach verwendeter Polymerase) halten. Die DNA-Polymerase baut nun den fehlenden Stränge mit freien Nukleotiden auf. Sie beginnt dafür am 3'-Ende des Primers und folgt dann dem DNA-Strang, der als Matrize dient. Der Primer wird nicht wieder abgelöst, da er den Anfang des neuen Stranges bildet.Die Schritte 2-4 werden 25-40 mal wiederholt.
5. Das Gemisch wird bei 4-8 °C aufbewahrt. Man kann die PCR am Abend vor dem Verlassen des Labors einleiten, so dass sie über Nacht läuft. Die DNA wird bei 4-8 °C nach nur einer Nacht nicht beschädigt.

Schematische Darstellung des PCR-Zyklus.
(1) Schmelzen (Denaturierung) bei ca. 96 °C.
(2) Anlagerung (Primerhybridisierung) bei ca. 68 °C.
(3) Verlängerung (Elongation) bei ca. 72 °C (P=Polymerase).
(4) Der erste Zyklus ist beendet.

[Bearbeiten] Aufreinigung von PCR-Produkten

Das PCR-Produkt in niedriger (Bande 2) und hoher (Bande 3) Konzentration im Vergleich mit der DNA-Leiter (Bande 1) in Agarose-Gel.

Das PCR-Produkt kann durch Agarose-Gelelektrophorese anhand seiner Größe identifiziert werden. (Die Agarose-Gelelektrophorese ist ein Verfahren, bei der DNA in ein Agarose-Gel eingebracht wird und anschließend eine Spannung angelegt wird. Dann bewegen sich die kürzeren DNA-Stränge schneller als die längeren auf den Pluspol zu.) Die Menge des PCR-Produkts kann durch einen Vergleich mit einer DNA-Leiter, die DNA-Fragmente bekannter Größe enthält und parallel zur Probe im Gel mitläuft, bestimmt werden.

[Bearbeiten] PCR bei HIV

Die PCR kann auch zu Reihenuntersuchungen eingesetzt werden. So wird sie z. B. von Blutspendediensten zur Routineuntersuchung von Blutkonserven eingesetzt. Durch die frühestmögliche Entdeckung einer gefährlichen Infektionskrankheit beim Spender (z. B. HIV, Hepatitis B) kann das sog. diagnostische Fenster nahezu geschlossen werden.

Kann obige Aussage seitens eines Fachmanns bezüglich HIV konkretisiert werden ? Ab welchen Zeitraum ( nach einem Risikokontakt ) kann man HIV mittels PCR nachweisen bzw. ausschliessen ?

[Bearbeiten] Links

Habe folgenden Link entfernt: * Auch für den Laien geeigneter Übersichtsartikel. Begründung: Er linkt auf einen Anbieter von Vaterschaftstest und ist somit Werbung.