Northern blot
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Il Northern blotting è una tecnica che permette di visualizzare ed identificare l'RNA purificato da un campione, in particolare per studiare l'espressione genica.
Tecnicamente, è simile al Southern Blotting, con la differenza sostanziale che l'RNA tende a formare strutture secondarie stabili in soluzione; per fare in modo che la mobilità elettroforetica sia solo dipendente dalla lunghezza del frammento, l'RNA deve essere preventivamente denaturato (solitamente esponendolo ad alte temperature). Inoltre, la corsa elettroforetica deve essere eseguita in presenza di agenti denaturanti, solitamente formaldeide e formammide.
Il nome è derivato dalla tecnica analoga per il DNA (Southern blot).
Indice |
[modifica] Fasi del protocollo
[modifica] Denaturazione
L'RNA viene riscaldato a ca. 70°C per 3-5 minuti, poi viene raffreddato rapidamente in un bagno di ghiaccio fondente. Una piccola quantità di un agente denaturante viene aggiunta (solitamente formammide) per mantenere l'RNA privo di strutture secondarie.
[modifica] Elettroforesi
L'elettroforesi permette di frazionare l'RNA in base al peso molecolare, e quindi in base alla lunghezza. Viene effettuata di solito su gel di agarosio in presenza di agenti denaturanti. Per visualizzare l'RNA durante l'elettroforesi, si può utilizzare l'etidio bromuro, che si lega debolmente all'RNA ed emette luce fluorescente quando esposto a luce ultravioletta.
[modifica] Trasferimento su membrana
L'RNA può essere trasferito su una membrana di nylon utilizzando il fenomeno della capillarità. Il gel viene preparato e incubato in una soluzione salina. La membrana viene poggiata al di sopra del gel ed una pila di carta assorbente viene posta al di sopra della membrana. Il movimento dell'acqua e degli ioni causa il trasferimento dell'RNA dal gel alla membrana, alla quale si lega mediante legami deboli. Per stabilizzare questi legami, il complesso membrana/RNA è sottoposto a crosslinking usando raggi ultravioletti.
[modifica] Ibridizzazione
Per identificare l'RNA in oggetto di studio si possono utilizzare diverse metodologie, ma la più diffusa prevede l'utilizzo di una sonda di DNA, cioè una sequenza di DNA complementare all'RNA (da cui la definizione di ibridizzazione o ibridazione). La sonda è spesso marcata con un isotopo radioattivo (ad esempio 32P) oppure con una molecola facilmente individuabile con altre tecniche, ad esempio la digossigenina.
[modifica] Visualizzazione
Questa dipende dal tipo di marcatura utilizzato durante l'ibridazione. Nel caso di un isotopo radioattivo, è possibile rilevare la posizione dell'RNA (legato adesso alla sonda marcata) esponendo la membrana ad una lastra fotografica.
