Chromatin-Immunopräzipitation
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Die Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) ist ein experimentelles Verfahren in der Molekularbiologie. Ziel der Methode ist es, festzustellen, ob bestimmte Proteine (meist Transkriptionsfaktoren) bestimmte Teile des endogenen Chromatin lebendiger Zellen oder Geweben binden. Da das Verfahren in vivo arbeitet, unterscheidet es sich wesentlich von anderen Verfahren, die das gleiche Ziel verfolgen, wie z. B. das DNAase Footprinting Assay .
[Bearbeiten] Grundsätzlicher Versuchsablauf
Das Grundprinzip der Chromatin-Immunopräzipitation (Kürzel: ChIP) beruht darauf, die zu einem Zeitpunkt bestehenden Protein-DNA-Bindungen durch Fixierung mit Formaldehyd festzuhalten. Anschließend werden die Zellen zerstört und das Chromatin mittels Ultraschall in Stücke von einigen hundert Basenpaaren Länge zertrümmert. Jene DNA-Stücke, die das gewünschte Protein gebunden haben, werden mit einem für das Protein spezifischem Antikörper immunopräzipiert (isoliert). Die isolierten DNA-Protein-Komplexe werden gelöst. Die Identität der jeweiligen DNA-Stücke kann auf verschiedene Weise geklärt werden: Hat man eine Hypothese über den wahrscheinlichen Bindungsort im Genom, kann man eine PCR unter Verwendung von Primern, die spezifisch für die vermutete DNA-Region sind. Ist man hingegen am Aufspüren aller Bindungsstellen des Proteins im gesamten Genom interessiert, kann ein DNA-Microarray verwendet werden. In diesem Fall spricht man auch von einem ChIP-on-chip-Experiment.
[Bearbeiten] Problem der Antikörpergewinnung
Das Hauptproblem der Chromatin-Immunopräzipitation ist es, hochspezifische Antikörper für die untersuchten Proteine zu finden. Eine Möglichkeit besteht darin, das gewünschte Protein mit einem Epitop zu verschmelzen, dass von verfügbaren Antikörpern erkannt wird. Eine weitere Möglichkeit ist die Verschmelzung mit einer Aminosäurenkette, die von bestimmten Enzymen erkannt werden, welche bestimmte Seitenketten des Proteins mit Biotin anreichern. Die Isolation der DNA-Protein-Komplexe wird dadurch ermöglicht, dass das Biotin wiederum äußert spezifisch mit extrem hoher Affinität das Protein Streptavidin bindet.
[Bearbeiten] Literatur
- V. Orlando, Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde-crosslinked-chromatin immunoprecipitation., Trends Biochem Sci. 2000, 25(3) pp. 99-104
