Enzima di restrizione

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L'enzima di restrizione EcoRI legato al DNA

Un enzima di restrizione è un complesso proteico in grado di rompere i legami fosfodiesterici base-base del DNA a doppio filamento. Il ruolo biologico di questi enzimi è di protezione e salvaguardia della cellula: nei procarioti questi enzimi sono essenziali per il taglio e la degradazione di filamenti estranei al genoma (come ad esempio quello derivante da una infezione fagica).

La scoperta degli enzimi di restrizione è dovuta a Werner Arber, microbiologo svizzero che ricevette il Premio Nobel nel 1978.

[modifica] Classi di enzimi di restrizione

Gli enzimi di restrizione sono divisi in tre categorie: le endonucleasi di tipo I,II,III.

Le endonucleasi di tipo I e III non necessitano di ATP come coenzima per il taglio e possono anche catalizzare reazioni di modificazione del DNA quali la metilazione (aggiunta di gruppi metilici a basi specifiche). Mentre le endunucleasi di tipo I effettuano l'idrolisi del DNA in punti casuali, quelle di tipo III riconoscono specifici siti bersaglio ed effettuano il taglio in corrispondenza o vicino a quest'ultimo.

Discorso a parte va fatto per le endonucleasi di tipo II, gli enzimi di restrizione propriamente detti. Questi enzimi, infatti, necessitano di ATP per la loro funzione ed il taglio avviene in corrispondenza di sequenze molto specifiche.

[modifica] Sequenze riconosciute

Ciascun enzima di classe II possiede una propria sequenza bersaglio (detta anche sequenza consenso), che riconosce e taglia. Questa sequenza, solitamente di 4-8 paia di basi, è detta sito di restrizione e permette di tagliare il DNA a livello di quel sito. Si tratta di siti con sequenze palindromiche: se lette secondo la stessa polarità, sono identiche nei due filamenti (ad es. 5'...GATC...3' è palindromica perché il suo complementare è 3'...CTAG...5', che letta da 5' a 3' corrisponde a GATC). Una conseguenza di questo fatto è che l'enzima di restrizione è un dimero, più precisamente un omodimero, perché deve riconoscere la stessa sequenza su entrambi i filamenti. Alcuni enzimi (detti rari), hanno siti di taglio poco presenti nel genoma (sono quelli con le sequenze più lunghe). Altri, come EcoRI, BamHI e HindIII, tra i più utilizzati, hanno siti di taglio ben più frequenti.

Sono possibili due tipi di taglio: il taglio sfalsato ed il taglio orizzontale.

Le estremità coesive prodotte dal taglio di EcoRI

• Il taglio sfalsato. Un esempio può essere il taglio effettuato dall'enzima di restrizione EcoRI di E. coli. La sequenza consenso di questa endonucleasi è:

5'...GAATTC...3'
     ||||||
3'...CTTAAG...5' 

L'enzima EcoRI produce un taglio sfalsato creando due estremità (dette coesive o sticky ends) a singolo filamento al 5':

5'...G    AATTC...3'
     |        |
3'...CTTAA    G...5' 

Le estremità coesive (cioè "appiccicose") che si sono create, possono appaiarsi con sequenze complementari.

• Il taglio orizzontale. Esempio di questo tipo di taglio è l'enzima SmaI:

5'...CCCGGG...3'
     ||||||
3'...GGGCCC...5' 

Il taglio di SmaI non produce estremità coesive:

5'...CCC  GGG...3'
     |||  |||
3'...GGG  CCC...5'

[modifica] Applicazioni

Gli enzimi di restrizione di classe II sono utilizzati in applicazioni di tipo biotecnologico. Ad esempio, nella tecnologia del DNA ricombinante, gli enzimi di restrizione di classe II sono impiegati per il clonaggio molecolare, che consiste nell'introduzione di un gene d'interesse in una molecola di DNA detta plasmide, in grado di replicarsi in un sistema ospite, spesso batterico, per produrre grandi quantità del gene o per permetterne l'espressione.

Affinché il gene venga inserito, sia il DNA del gene che del plasmide vengono trattati con lo stesso enzima di restrizione: al termine della reazione, sia il plasmide che il gene presenteranno delle estremità terminali simili. In particolare, se l'enzima utilizzato produce un taglio sfalsato, le estremità coesive prodotte tenderanno ad associarsi in prensenza dell'enzima DNA ligasi, che catalizza la reazione di ligazione.

Un'altra applicazione pratica consiste nell'analisi, ad esempio in medicina forense, degli RFLP (Restriction fragment length poymorphism, polimorfismi di lunghezza da frammenti di restrizione). Quando un sito polimorfico, contenente una sequenza consenso per un enzima di restrizione, viene mutato, è possibile osservare in maniera differenziale l'attività di taglio dell'enzima stesso. Se non si visualizza nessun taglio, sarà presente alcuna mutazione sul sito specifico dell'enzima. Se, in caso contrario, il taglio avviene, il sito specifico sarà intatto e non mutato.

[modifica] Esempi

5'GAATTC
3'CTTAAG

5'---G     AATTC---3'
3'---CTTAA     G---5'

5'GGATCC
3'CCTAGG

5'---G     GATCC---3'
3'---CCTAG     G---5'

5'AAGCTT
3'TTCGAA

5'---A     AGCTT---3'
3'---TTCGA     A---5'

5'CCTNAGG
3'GGANTCC

5'TCGA
3'AGCT

5'---T   CGA---3'
3'---AGC   T---5'

5'GCGGCCGC
3'CGCCGGCG

5'GANTC
3'CTNAG

5'AGCT
3'TCGA

5'---AG  CT---3'
3'---TC  GA---5'

[modifica] Collegamenti esterni

• (EN) Autobiografia di Werner Arber
• (EN) Banca dati degli enzimi di restrizione (REBASE)