Cromatografía de líquidos
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La Cromatografía de líquidos es una técnica ampliamente utilizada que permite separar físicamente y cuantificar los distintos componentes de una solución. En toda cromatografía existe un contacto entre dos fases, una fija que suele llamarse fase estacionaria, y una móvil (fase móvil) que fluye permanente durante el análisis, y que en este caso es un líquido. Las sustancias que permanecen más tiempo, libres en la fase móvil, avanzan más rápidamente con el fluir de la misma y las que quedan más unidas a la fase estacionaria o retenidas avanzan menos y por tanto tardarán más en salir o fluir. Éste es el principio fundamental de la cromatografía.
[editar] Métodos de cromatografía líquida
| Método | Abreviatura | Mecanismo predominante |
| Líquido, sólido o de adsorción | LSC | Adsorción sobre la superficie |
| Líquido | LLC | Reparto entre fases líquidas, una móvil y la otra estacionaria. |
| Fase enlazada | BPC | Reparto y / o adsorción entre las fases móvil y enlazada. |
| Pares de iones | IPC | Separación de pares de iones entre las fases móvil y enlazada. |
| Intercambio iónico | IEC | Uso de la carga por adsorción sobre un sitio iónico fijo por medio de intercambio de cationes o de aniones. |
| Exclusión estérica | EC | Aprovechamiento del tamaño de las moléculas por su difusión dentro de poros de tamaño adecuado. |
| Afinidad | -- | Uso de la estructura de ligantes inmovilizados para unir bioselectivamente la proteína deseada. |
[editar] Selección de un método de cromatografía líquida
El conocimiento de la estructura molecular de los componentes de la muestra puede ser muy útil en la selección de un método de cromatografía líquida. Una guía muy general para la selección de un método se da a continuación.
La cromatografía de adsorción opera mejor en la separación por clases de compuestos o para la separación de compuestos isoméricos. La técnica de cromatografía líquido – líquido es mejor para la separación de homólogos. Los grupos funcionales que son capaces de formar enlaces de hidrógeno fuertes se retienen mucho en cromatografía de adsorción, sin embargo la CLL(Líquido – líquido) proporciona una alternativa para la separación de estos compuestos, estas serán las muestras que tienen polaridad media y son solubles en disoluciones orgánicas débilmente polares, en general en CLL se logra emparejando la polaridad de la fase estacionaria con la de la muestra y utilizando una fase móvil con una polaridad marcadamente diferente.
La más utilizada es la de fase enlazada, BPC, Reparto y/o adsorción entre las fases móvil y enlazada, y en especial la fase reversa (especialmente la C18) pues permite separar tanto compuestos con cierta apolaridad como compuestos iónicos mediante el uso de la técnica de supresión de la ionización o de la cromatografía de par iónico dependiendo del pH de máxima estabilidad de la columna.
Los grupos iónicos y los ionizables sugieren el uso de la cromatografía de intercambio iónico o de pares de iones cuando la muestra es soluble en agua y los pesos moleculares son menores de 2000 daltons.
Cuando se sabe o se sospecha que el peso molecular excede de 2000 daltons para alguno o todos los componentes de la muestra, entonces es indicado el uso de cromatografía de exclusión (permeación en gel). Este método se basa en la actitud de los sustratos de porosidad controlada para clasificar y separar muestras de mezclas de acuerdo al tamaño y forma molecular.
Un procedimiento cromatográfico adicional depende de la estructura de los solutos considerada como un todo y no como función de grupos funcionales específicos o de la carga y el tamaño. La cromatografía de afinidad utiliza especies bioquímicas inmovilizadas como fase estacionaria para separar uno o algunos solutos de entre cientos de ellos que no se retienen. Las separaciones explotan el enlace de cerradura y llave que prevalecen en los sistemas biológicos.
