Random priming
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Unter Random priming (oder auch random-primed oligo-labeling) versteht man in der Molekularbiologie eine Technik zur Markierung von DNA. Dabei synthetisiert man an denaturierte (einzelsträngige) DNA mit Hilfe von kurzen Primern als Startpunkt einen markierten Gegenstrang.
Zu Beginn wird die zu markierende DNA denaturiert. Danach wird ein Gemisch aus, meist 6nt, seltener auch etwas längeren Oligonukleotiden mit zufälliger Sequenz hinzugegeben und diese in einer als annealing bezeichneten Phase an den Gegenstrang angelagert. Das als „Klenow-Enzym“ bezeichnete Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli nutzt diese Primer, um den Gegenstrang mit Hilfe markierter Nukleotide zu synthetisieren. Man benutzt nur das Klenow-Fragment, da dieses zwar von 5' nach 3' synthetisieren und von 3' nach 5' Nukleotide herausschneiden kann (Exonuklease-Aktivität), aber nicht von 5' nach 3' schneiden kann. Dadurch stoppt das Klenow-Enzym, wenn es auf den nächsten Primer stößt, der durchschnittlich nach 500 bis 2000 Basen (je nach Primer) kommt.
Die Markierung der DNA kann wie bei der Nick translation durch radioaktiv markierte Nukleotide oder durch einen Linker (Digoxygenin, Fluoreszenzmarker u.a.) verknüpfte Basen erfolgen. Durch die nur kurzen zu synthetierenden Stränge ist dieses System sehr einfach und schnell.
[Bearbeiten] Literatur
- A. P. Feinberg, B. Vogelstein: A technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity. Anal. Biochem. 1983 Jul 1;132(1):6-13. Abstract bei PubMed
