Coloration de Gram
Un article de Wikipédia, l'encyclopédie libre.
La coloration de Gram doit son nom au bactériologiste danois Hans Christian Gram qui mis au point le protocole en 1884. C'est une coloration qui permet de mettre en évidence les propriétés de la paroi bactérienne, et d'utiliser ces propriétés pour les distinguer et les classifier. Son avantage est de donner une information rapide sur les bactéries présentes dans un produit ou un milieu tant sur le type que sur la forme.
- Réalisation du frottis :
Elle nécessite d'avoir un frottis fixé, soit
- par l'alcool durant 5 minutes (et rinçage à l'eau),
- plus classiquement en effectuant une fixation simple à l'eau et à la flamme selon les indications suivantes : sur une lame, déposer une goutte d'eau stérile. Ajouter à l'anse de platine stérilisée une goutte de la colonie isolée. Etaler et fixer à la chaleur à environ 40°C pendant 10 à 15 minutes. Poser la lame sechée sur le portoir reposant sur un bac de coloration.
- Réalisation de la coloration
Voici succinctement les différentes étapes de cette coloration :
- Coloration par le violet de gentiane ou cristal violet. Laisser agir de 30 secondes à 1 minute. Rincer à l'eau déminéralisée.
- Mordançage au lugol (Solution d'iode iodo-iodurée): étaler le lugol et laisser agir 20 secondes ; Rincer à l'eau déminéralisée. On peut réaliser une deuxième fois l'opération identiquement pour plus de sécurité.
- Décoloration (rapide) à l'alcool (+acétone): verser gouttes à gouttes l'alcool ou un mélange alcool-acétone sur la lame inclinée obliquement, et surveiller la décoloration (5 à 10 secondes). Le filet doit être clair à la fin de la décoloration. Rincer sous un filet d'eau déminéralisée;
- Recoloration à la safranine ou à la fuschine. Laisser agir de 30 secondes à 1 minute. Laver doucement à l'eau déminéralisée. Sécher la lame sur une platine chauffante à 40°C, 10 à 15 minutes.
- Observer avec une goutte d'huile à immersion objectif 100 (grossissement x1000).
Les étapes 1 et 2 colorent en violet le contenu de la bactérie. Le violet de gentiane se fixe sur les composants cytoplasmiques de toutes les bactéries. Le lugol permet de fixer cette coloration interne.
L'étape 3 (alcool) sert à décolorer le cytoplasme des bactéries qui seront dites « Gram négatives ». En effet, celles ci ont une paroi riche en lipides (phospholipides, LPS) qui va laisser passer l'alcool (molécule lipophile)ou le mélange alcool-acétone, et qui décolorera le cytoplasme en éliminant le violet de gentiane. Au contraire, pour les bactéries dites « Gram positif »la paroi constitue une barrière imperméable à l'alcool car trop épaisse et gluco-protéique. Elles resteront alors violettes.
L'étape 4 est une contre-coloration ayant pour but de redonner aux bactéries Gram négatives précédemment décolorées une teinte rose permettant de les visualiser au microscope. Les bactéries à Gram positif restées violettes seront évidemment insensibles à cette contre-coloration plus pâle que le violet imprégant leur cytoplasme.
Ces différences de coloration et les différences de formes (bacille ou cocci) sont à l'origine de la classification des bactéries.
Nota: Certains germes restent insensibles à cette coloration, c'est le cas, entre autre, des mycobactéries (famille à laquelle appartiennent les agents de la tuberculose et de la lèpre)
[modifier] Voir aussi
 |
Portail de la microbiologie – Accédez aux articles de Wikipédia concernant la microbiologie. |
