אימונוהיסטוכימיה

מתוך ויקיפדיה, האנציקלופדיה החופשית

בביולוגיה, אימונוהיסטוכימיה (Immunohistochemistry) היא שיטה לאיתור ומיקום חלבונים בחתך של רקמה. איתור החלבון נעשה על ידי קישור של נוגדנים ספציפיים, והצפיה בו תחת מיקרוסקופ אור מתאפשרת על ידי אנזימים הגורמים לתגובת צבע.

אימונוהיסטוכימיה משמשת כאמצעי אבחון מחלות סרטניות וגם כשיטת מחקר המאפשרת איתור חלבונים שונים ברקמות שונות ובחינת השפעתם על הפתוגנזה של מחלות שונות.

תוכן עניינים 1 שיטות צביעה 1.1 שני נוגדנים 1.2 שינויים בפרוטוקול 1.3 אימונוהיסטוכימיה פלורוסנטית 2 אימונוהיסטוכימיה כאמצעי אבחון 3 קישורים חיצוניים

[עריכה] שיטות צביעה

הגורמים המקובלים ליצירת תגובת הצבע הם האנזימים פרוקסידאז של חזרת (Horseradish peroxidase או HRP) או אלקליין פוספטאז (alklaline phosphatase). תגובה בין האנזימים לסובסטרט מסיס וחסר צבע יוצרת צבע בלתי מסיס הצובע את האזורים בהם מצוי החלבון הנבדק.

[עריכה] שני נוגדנים

השיטה המקובלת ביותר ברפואה ובמחקר הרפואי מבוססת על צביעה בעזרת שני נוגדנים: נוגדן ספציפי לחלבון הנבדק (נוגדן ראשוני) ונוגדן ספציפי לנוגדן הראשוני, המצומד כימית לאנזים (נוגדן שניוני). השלבים הם כדלהלן:

1. קיבוע הרקמה - רקמה שהוצאה מאדם, בעל חיים או צמח נחשפת לחומר מקבע, לרוב פורמלין, ולאחר מכן לפרפין נוזלי חם. עם קירורו, הפרפין נקרש ובכך מאפשר את חיתוך הרקמה לפרוסות דקות. לרוב הרקמה נפרסת בחתכים בעובי 5 מיקרומטר. הפרוסות נספחות לזכוכית נושאת. כדי למנוע התקלפות הפרוסה מן הזכוכית, מצופה הזכוכית בחומר הטוען אותה במטען חיובי (המושך את מקרומי התאים הטעונים שלילית).
2. דה-פרפינציה - הפרפין מוסר מן הרקמה בעזרת חשיפה לקסילן ולריכוזים שונים של אתנול.
3. חשיפת אנטיגן - הקיבוע עלול לגרום לקשרי צילוב המפריעים לזיהוי האנטיגן על ידי הנוגדן. כדי למנוע את הבעיה ניתן לחשוף את האנטיגן על ידי הרתחת הדוגמה למשך 10-20 דקות בבופר (לרוב בופר ציטרט). ניתן לחשוף אנטיגנים גם על ידי אנזימים פרוטאוליטים (חותכי חלבונים) שונים כמו טריפסין או כמוטרפסין, שימוש באנזימים אלו מצריך כיול כיוון חשיפת יתר עלולה להרוס את החלבון הנבדק.
4. חסימת פרוקסידאז אנדוגני - כאשר נעשה שימוש באנזים פרוקסידאז (HRP) יש להפסיק תחילה את פעילות האנזים המצוי באופן טבעי ברקמה (הפרוקסידאז האנדוגני). ניתן לחסום את פעילות האנזים על ידי חשיפתו לתמיסת מי חמצן (פרה- אוקסיד).
5. נוגדן ראשוני - הרקמה נחשפת לנוגדן ראשוני בעל ספציפיות לאנטיגן מסוים, לרוב הנוגדן הוא מונוקלונלי המיוצר בעכבר או פוליקלונלי המיוצר בארנבת.
6. נוגדן שניוני - הרקמה נחשפת לנוגדן שניוני בעל ספציפיות לחלק הקבוע של הנוגדן הראשוני. לנוגדן השניוני מצומד אנזים הגורם לתגובת צבע כאשר הוא בא במגע עם סובסטרט מתאים.
7. סובסטרט - הצביעה הספציפית מתקבל כתוצאה מחשיפה של הכרומוגן- חומר מסיס ולרוב חסר צבע שאחרי פעילות של אנזים הופך לבעל צבע ובילתי מסיס. הכרומוגנים העיקריים המשמשים בצביעות אימונוהיסטוכימיות הוא DAB (3,3’-diaminobenzidine) הנותן צבע חום או AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) הנותן צבע אדום.
8. צביעת ניגוד (Counterstain) - כדי להבחין התאים נהוג לצבוע את התאים בעזרת צבע ניגוד הצובע את כל התאים באופן לא ספציפי. צבע הניגוד המקובל הוא מבוסס על המטוקסילין Hematoxylin הצובע בכחול את גרעין התא .
9. יבוש (דהידרציה) והדבקת זכוכית מכסה - לרוב הדבק המשמש להדבקת הזכוכית המכסה מבוסס על ממס אורגני שאינו מתערבב במים, לפיכך יש להוציא את כל הנוזלים המימיים לפני הדבקת הזכוכית במכסה, ניתן להוציא נוזלים אלו על ידי העברת רקמה בסדרה של כהלים הריכוזים עולים ולבסוף בקסילן. לאחר יבוש הדוגמה ניתן להדביק זכוכית מכסה ולצפות בדוגמה במיקרוסקופ אור.

[עריכה] שינויים בפרוטוקול

• קישור ביוטין-סטרפאבידין במקום נוגדן שניוני מצומד ב-HRP ניתן להשתמש בנוגדן שניוני שעבר ביוטינילציה, הצמדת מולקולות ביוטין. בשלב הבא מוסף סטרפאבידין מצומד לאנזימי HRP. שינויים אלו בפרוטוקול מאפשרים קישור של יותר אנזימי HRP לכל נוגדן שניוני, ולכן הצביעה חזקה יותר.

• סימון נוגדן ראשוני ניתן לצמד HRP באופן ישיר לנוגדן הראשוני ולכן אין צורך בנוגדן שניוני. היתרונות בשיטה הוא הורדת רקע כתוצאה מקישור לא ספציפי של נוגדן שניוני וחיסכון בזמן. החיסרון הוא שצימוד אנזים לנוגדן מייקר מאוד את עלות הנוגדן, לכן סימון נוגדן ראשוני משמש בעיקר לבדיקות רפואיות נפוצות במעבדות רפואיות גדולות.

[עריכה] אימונוהיסטוכימיה פלורוסנטית

בגרסה נדירה יותר של אימונוהיסטוכימיה, סימון הנוגדן נעשה בעזרת חומרים פלורוסנטים כגון FITC. לפי שיטה זו ניתן לסמן שני חלבונים שונים בעזרת שני צבעים שונים ובנוסף, על ידי שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי ניתן לצפות באברוני תא קטנים (כגון גולג'י או וסיקולות שונות) שאינם נראים בעזרת מיקרוסקופ אור רגיל המשמש לאימונוהיסטוכימיה בצבע. לשם כך, במקום נוגדן שניוני מצומד לאנזים HRP, נעשה שימוש בנוגדן שניוני מצומד למולקולה פלורוסנטית. צביעת ניגוד נעשית בדרך כלל על ידי שימוש ב-DAPI, חומר פלורוסנטי המסמן DNA, ולכן גרעין התא מסומן על ידו ככחול.

ניתן להבחין בצביעה פלורוסנטית על ידי מיקרוסקופ פלורוסנטי או מיקרוסקופ קונפוקאלי, מיקרוסקופים אלו מקרינים את הדוגמה באור מקוטב או בקרן לייזר מונוכרומטית. כתוצאה מכך פולטות המולקולות הפלורוסנטיות אור באורך גל שונה מזה הנקלט בהן. על ידי סדרה של מסננים ניתן לראות רק את האור הנפלט מן המולקולות הפלורוסנטיות ובכך לסמן את התאים הנושאים את האנטיגן.

יתרון הצביעה הפלורוסנטית הוא בכך שניתן לסמן מספר אנטיגנים על ידי שימוש במספר חומרים פלורוסנטים, בנוסף, בעזרת סימון פלורוסנטי ניתן להבחין באברונים קטנים שאינם מובחנים בצביעה אימונוהיסטוכימית רגילה.

[עריכה] אימונוהיסטוכימיה כאמצעי אבחון

אימונוהיסטוכימיה משמשת לאבחון מחלות סרטניות שונות כיוון שהמצאות חלבונים שונים אופיינית למחלות שונות. בנוסף, במחלות מסוימות אבחון רמת הביטוי של חלבונים ספציפיים ברקמת גידול מאפשר התאמת הטיפול האפקטיבי ביותר לחולה. לדוגמה, חולת סרטן השד שתאי הגידול הסרטני שלה מבטאים קולטנים לאסטרוגן יכולה להיות מטופלת בהורמונים אנלוגים לאסטרוגן כמו טמוקסיפן.

[עריכה] קישורים חיצוניים

• עולם האימונוסיסטוכימיה פרוטוקולים, גלריות וייעוץ באימונוהיסטוכימיה והיסטוכימיה
• פרוטוקול און-ליין פרוטוקולים לאימונוהיסטוכימיה