Enzyme de restriction

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Une enzyme de restriction est une protéine en biologie moléculaire qui peut couper un fragment d'ADN au niveau d'une séquence de nucléotides caractéristique appelée site de restriction. Chaque enzyme de restriction reconnait ainsi un site spécifique. Plusieurs centaines d'enzymes de restriction sont actuellement connues, on en retrouve naturellement un grand nombre d'espèces de bactéries.

[modifier] Rôle biologique

Les enzymes de restriction sont produites par des bactéries et constituent un mécanisme de défense contre les infections par les bactériophages, des virus spécifiques des bactéries. Lorsque le virus injecte son ADN dans le micro-organisme, celui-ci est coupé par l'enzyme de restriction au niveau de ses sites specifiques. La destruction du génome du virus bloque ainsi l'infection. Le nom d'enzyme de restriction provient de ce mécanisme, en effet la présence de ces enzymes dans les bactéries restreint l'infectiosité des bactériophages.

Pour éviter que l'enzyme de restriction ne coupe l'ADN de son propre génome, la bactérie fabrique aussi une deuxième enzyme appelée méthylase qui reconnait également le site de restriction. La méthylase ne coupe pas l'ADN, mais le modifie en lui rajoutant un groupement méthyle sur un ou plusieurs nucléotides du site. Cette méthylation empêche la coupure par l'enzyme de restriction.

Ce mécanisme de défense, appelé système de restriction/modification, associe systématiquement ces deux enzymes, l'une de coupure et l'autre de protection.

[modifier] Propriétés

Les enzymes de restrictions appartiennent à la classe des endonucléases, c'est-à-dire des enzymes capables de cliver les liaisons phosphodiester entre deux nucléotides à l'intérieur de la chaîne d'un acide nucléique. Les endonucléases diffèrent des exonucléases, puisqu'elles peuvent cliver les brins d'ADN de manière interne, alors que les exonucléases n'attaquent la molécule d'ADN qu'au niveau de ses extrémités.

les enzymes de restriction sont capables de reconnaitre spécifiquement une courte séquence de l'ADN de 4 à 10 paires de bases, et de cliver les deux brins du duplex d'ADN au site reconnu. Cette propriété a depuis longtemps été utilisée en biologie moléculaire, puisqu'elles permettent de fragmenter l'ADN en segments de taille réduite en coupant à des sites définis.

Les enzymes de restriction peuvent être utilisées pour établir une carte génétique (appelée "carte de restriction") d'une molécule d'ADN. La carte de restriction donne l'ordre des sites de restriction le long de cette molécule, et la taille des fragments produits. Cette technique de caractérisation des acides nucléiques, très utilisée voici une vingtaine d'années, est supplantée par le séquençage direct, devenu bien moins couteux et réalisé de façon routinière.

Selon la relation spatiale entre la séquence reconnue et le lieu de coupure, il est possible de distinguer trois types d'enzymes de restriction. Les enzymes de type I et de type III reconnaissent une séquence d'ADN spécifique et coupent en un endroit aléatoire, en général assez éloigné du site reconnu. Les enzymes de type II, les plus utilisées, reconnaissent une séquence spécifique et coupent en un endroit spécifique de cette séquence. Quelques exemple de ces enzymes figurent ci-dessous.

[modifier] Exemples d'enzymes de type II

Enzyme	Source	Sequence reconnue	Coupure
Eco RI	Escherichia coli	5'GAATTC 3'CTTAAG	5'---G AATTC---3' 3'---CTTAA G---5'
BamHI	Bacillus amyloliquefaciens	5'GGATCC 3'CCTAGG	5'---G GATCC---3' 3'---CCTAG G---5'
HindIII	Haemophilus influenzae	5'AAGCTT 3'TTCGAA	5'---A AGCTT---3' 3'---TTCGA A---5'
MstII	Microcoleus species	5'CCTNAGG 3'GGANTCC
TaqI	Thermus aquaticus	5'TCGA 3'AGCT	5'---T CGA---3' 3'---AGC T---5'
NotI	Nocardia otitidis	5'GCGGCCGC 3'CGCCGGCG
HinfI	Haemophilus influenzae	5'GANTC 3'CTNAG
AluI	Arthrobacter luteus	5'AGCT 3'TCGA	5'---AG CT---3' 3'---TC GA---5'

[modifier] Utilisations

Les digestions enzymatiques se font généralement dans un microtube mis au bain-marie à température convenablement réglé (généralement 37°C) sur un portoir flottant.