דנטורציה
מתוך ויקיפדיה, האנציקלופדיה החופשית
דנטורציה (מאנגלית: denaturation - שינוי בתכונות) היא תהליך שבו משתנה המבנה המרחבי הטבעי והפעיל של תרכובת אורגנית גדולה, כשהמושג מתייחס בדרך כלל לחלבונים או לחומצות גרעין. הדבר יכול להיגרם עקב עקת חום או חומציות, או מנוכחותם של חומרים שונים בקרבת המולקולה.
בחלבונים, שינוי המבנה המרחבי פוגע בתפקוד החלבון ומוציא אותו מכלל פעולה. דנטורציה המתקיימת במלואה בתנאים תאיים היא בלתי הפיכה בדרך כלל, והחלבון לא יחזור למבנה הפעיל לאחריה. אך אם הדנטורציה לא התרחשה במלואה, או שהתרחשה בתנאי מעבדה, יכול להתקיים התהליך ההפוך - רנטורציה, והחלבון ישוב לתפקד לאחר זמן מה.
בחומצות גרעין דנטורציה מתבטאת בהפרדה בין שני גדילי ה-DNA, ולה שימושים רבים במחקר הגנטי ומחוץ לו. רנטורציה, חיבורם של שני הגדילים זה לזה, היא התהליך ההפוך, וגם היא נפוצה במחקר בצמוד לדנטורציה.
תוכן עניינים |
[עריכה] דנטורציה בחלבונים
[עריכה] המבנה המרחבי של החלבון
ערך מורחב – חלבון
החלבון הוא מולקולה גדולה במיוחד הבנויה מיחידות של חומצות אמיניות. בחלבון ממוצע תהיינה בדרך כלל למעלה ממאה חומצות אמיניות הקשורות זו לזו בקשר פפטידי, שהוא קשר קוולנטי בין חומצות האמינו הסמוכות. קיימות בטבע 20 חומצות אמיניות סטנדרטיות שונות הנבדלות זו מזו בקבוצה הצדדית שלהם (המכונה גם קבוצת ה-R). הבדל זה גורם לשוני בסוג ובטיב האינטראקציות שבהן יכולה להשתתף החומצה האמינית. אינטראקציות אלה הן קשרים לא קוולנטיים, חלשים, בין חומצה אמינית לחברתה, או בין חומצה אמינית לחומר אחר. אינטראקציות אלה קובעות את המבנה המרחבי (הקונפורמציה) של החלבון. בין האינטראקציות החשובות נמנה קשר המימן: חומצות אמיניות בעלות קבוצה צדדית קוטבית עשויות ליצור קשרי מימן עם חומרים הידרופילים המצויים בסביבתם. קשרי מימן נוצרים בין חומצות אמינו באזורים שונים בחלבון וגורמות לקיפולים בשרשרת הפוליפפטידית (שרשרת חומצות האמינו). המים גם הם יוצרים קשרי מימן. לכן, קבוצות קוטביות ימצאו לעתים קרובות על פני החלבון, חשופים לסביבה המימית.
כוחות של משיכה ודחייה חשמלית עשויים גם הם להיווצר בין קבוצות צדדיות מסוימות הנושאות מטען. הם ירחיקו או יקרבו קטעי חלבון זה לזה וכך יתרמו לייצוב המבנה המרחבי. קשר חשוב נוסף הוא הקשר הדיסולפידי: קשר בין אטומי גופרית של הקבוצות הצדדיות של החומצה האמינית ציסטאין. פעולתו דומה לפעולת האינטראקציות הקודמות, אך כיוון שזהו קשר קוולנטי הוא חזק מהן.
המבנה המקופל הנוצר בעקבות אינטראקציות אלה הוא המבנה בעל הרמה האנרגטית הנמוכה ביותר מבין אינסוף המבנים האפשריים, ולכן זהו המבנה היציב ביותר של החלבון.
[עריכה] הגורמים לדנטורציה
מכיוון שמבנה החלבון מיוצב על ידי קשרים חלשים רבים, היוצרים מבנה מורכב ומסובך להפליא, שינוי בתנאי הסביבה של החלבון עשוי לפגוע באינטראקציות שבין החומצות האמיניות. פגיעה זו מעוותת את מבנה החלבון. כיוון שמבנה החלבון הוא המאפשר את תפקודו, בעקבות דנטורציה יפגע תפקוד החלבון.
קיימים מספר גורמים לדנטורציה:
- טמפרטורה גבוהה.
- שינוי pH הטבעי המתאים לחלבון.
- כוח מכני.
- חומרים שונים המשמשים בעיקר למחקר ביוכימי.
- קרינה
[עריכה] טמפרטורה
כשמעלים את הטמפרטורה של גוף מסוים הדבר מתבטא בהגברת מהירות החלקיקים שמהם הוא מורכב. כשמחממים חלבונים מוגבר למעשה קצב תנודות האטומים בחלבון. הדבר גורם לכך שאותן אינטראקציות חלשות בין חומצות האמינו המרכיבות את החלבון תתפרקנה והמבנה הטבעי יתערער. התוצאה היא שרשרת אקראית חסרת מבנה מוגדר. תהליך זה מתרחש גם בעת בישול (או טיגון) ביצה. בלובן הביצה מצויים חלבונים רבים, כשאחד הנפוצים שבהם הוא אלבומין. החלבונים מתחממים והקשרים הלא-קוולנטיים שבהם מתפרקים וגורמים להיחלשות המבנה. בטמפרטורה מסוימת המבנה קורס בבת אחת למבנה אקראי, והאלבומין הופך למשקע לבן. מכאן ניתן לומר שתהליך הדנטורציה איננו הדרגתי: מיד לאחר שהיחלשות האינטראקציות עוברת סף מסוים, קורס המבנה בבת אחת. סף זה מצוי ברוב החלבונים מתחת ל-70 מעלות צלזיוס. חלבוני חיידקים תרמופיליים, החיים בטמפרטורות הקרובות ל-100 מעלות, בקרבת מבועים ומעיינות חמים, הם היוצאים מהכלל. לחלבונים המופקים מחיידקים אלה מקום מרכזי בשיטות מעבדתיות כגון PCR.
העובדה שלכל חלבון ישנן טמפרטורות בהן הסיכוי שיעבור דנטורציה גבוה במיוחד, יוצרת גבול עליון של טמפרטורה לפעילות החלבון. טמפרטורות נמוכות גם הן לא מאפשרות את פעילותו של החלבון, לא בשל דנטורציה אלא מכיוון שככל שהטמפרטורה נמוכה יותר המולקולות נעות לאט יותר, פעילות החלבון גם היא איטית יותר (מכיוון שהיא מוכתבת בין השאר על ידי מהירות התנועה). בטמפרטורות נמוכות מדי, החלבון איננו פועל ביעילות בשל המהירות הנמוכה של המולקולות בתמיסה, מה שיוצר גבול תחתון לפעילותו של החלבון. לכן לכל חלבון טווח טמפרטורות אידאלי לפעילותו. הטמפרטורה האידאלית לחלבוני גוף האדם היא בין 36 ל-38 מעלות צלזיוס. בטמפרטורות אלה עוד לא מתרחשת דנטורציה, אך הן מספיק גבוהות כדי שפעילות החלבון תהיה יעילה.
[עריכה] שינוי ה-pH
שינוי בחומציותה של תמיסת החלבון גורמת גם היא לדנטורציה. ככל שתמיסה חומצית יותר, יש בה למעשה יותר יוני מימן (+H, או ליתר דיוק +H3O). העלאה או הורדה בריכוזם של יוני המימן גורם ליינונן של קבוצות צדדיות של חומצות אמיניות מסוימות, וטעינתן במטען חשמלי. המטען החשמלי גורם למשיכה או לדחייה חשמלית שלא הייתה קיימת קודם לכן בין קטעי חלבון שונים. אלו הן אינטראקציות חדשות בין חומצות האמינו, שלא היו קיימות לפני כן. הדבר מערער את המבנה הטבעי של החלבון וגורם לפתיחה חלקית שלו. פתיחה זו חושפת לסביבה החומצית או הבסיסית קבוצות צדדיות שלא היו חשופות עד כה ומיינן גם אותן, מה שגורם לקריסתו הסופית של החלבון לשרשרת אקראית חסרת מבנה.
לכל חלבון טווח pH שבו הוא נותר במצבו הטבעי והפעיל, על אף שינוי ריכוז יוני המימן. חלק נכבד מהחלבונים לא יכולים לחרוג בהרבה מה-pH הפיזיולוגי, בין 6 ל-8 pH. אך ישנם חלבונים רבים היוצאים מכלל זה, כגון האנזימים הפועלים בקיבה (פרוטאזות) כגון פפסין, ומסייעים בעיכולם של חלבונים אחרים. במיצי הקיבה מצויה חומצת מימן כלורי (HCl), שהיא חומצה חזקה. הסביבה החומצית גורמת לדנטורציה בחלבונים שבמזון, ובכך מסייעת לאנזימי העיכול (שהם כאמור סוג של חלבון) לפרק את הקשרים הפפטידיים שבין החומצות האמיניות. זאת בעוד האנזימים כלל לא נפגעים, ויותר מכך, מופעלים רק בנוכחות חומצה.
[עריכה] חומרים דנטורטיביים
דנטורציה עשויה להתרחש גם בעקבות נוכחות חומרים אחדים בתמיסת החלבון, הפוגעים במבנהו. חלק מחומרים אלה משמש בעיקר למחקרים ביוכימיים שונים הדורשים התרה של המבנה המרחבי של החלבון למבנה ראשוני פשוט.
- דטרגנטים: הדטרגנטים הם חומרים אורגניים בעלי "זנב" הידרופובי ("שונא מים") ו"ראש" הידרופילי ("אוהב מים") הנושא לעתים קרובות מטען חשמלי. כשמולקולת דטרגנט פוגשת בחלבון, זנבה ההידרופובי חודר למעמקי החלבון ויוצר אינטראקציות מתחרות עם הקבוצות הצדדיות של החומצות האמיניות ההידרופוביות. איטראקציות אלה מחלישות את האינטראקציות הקיימות בחלבון הטבעי. באופן דומה, הראש ההידרופילי מגיב עם הקבוצות ההידרופיליות שעל פני החלבון ומחליש את האינטראקציות ביניהן. כשריכוז הדטרגנט גבוה מספיק, תתרחש דנטורציה ומבנה החלבון יקרוס למבנה אקראי. הדטרגנט SDS הוא בין הנפוצים שבדטרגנטים במעבדות לצורכי דנטורציה, בין השאר בשל תפקידו בשיטות הפרדת חלבונים באלקטרופורזה בג'ל. בשיטות אלו גורמים לדנטורציה של החלבונים טרם הפרדתם אחד מרעהו, כדי שההפרדה תהיה תקינה.
- ממסים אורגניים: חומרים אורגניים המסיסים במים כגון כוהל, עשויים להתחרות גם הם על האינטראקציות ההידרופוביות בפנים החלבון ולהחליש אותן כמו הזנבות ההידרופוביים של הדטרגנט. לכן בריכוז גבוה מספיק גם הם מתפקדים כחומרים דנטורטיביים, הגורמים להרס מבנה החלבון.
- ריאגנטים סולפהידריליים: חומרים שונים, כגון בטא-מרקפטואתנול, עשויים לחזר את הגופרית שבקשרים הדיסולפידיים (S-S) לקבוצות סולפהידריל (SH-). תהליך זה מפרק את הקשר הסולפידי ובכך פוגע במבנה החלבון. עם זאת, לא ניתן להסתפק בחומרים אלה בלבד כדי לגרום לדנטורציה כיוון שהקשרים הדיסולפידים מהווים בדרך כלל חלק קטן מכלל הקשרים המייצבים את החלבון. תהליך חיזור הגופרית באמצעות ריאגנטים סולפהידריליים נפוץ במעבדות מחקר.
- שינן וגואנידין הידרוכלוריד: אלו הם שני חומרים הנפוצים מאוד במעבדות ביוכימיה ומשמשים לניסויים רבים הדורשים דנטורציה. אך למרות זאת, דרך תפקודם כחומרים דנטורטיביים עודנה שנויה במחלוקת. בעבר סברו שהם מתחרים על יצירת קשרי מימן עם החומצות האמיניות ובכך מחלישים את קשרי המימן המייצבים את המבנה הטבעי. אך מבדיקה של חומרים אלה נמצא שהשפעתם בדרך זו לא גדולה מהשפעתם של המים. כיוון שהחלבון נמצא כל העת בסביבה מימית ואינו ניזוק, נותר להסיק שזוהי איננה דרכם של השינן וגואנידין הידרוכלוריד. סברה אחרת שזכתה להתייחסות היא שמולקולות אלה חושפות בדרך כלשהי את הקבוצות ההידרופוביות והלא קוטביות לסביבה המימית והקוטבית ובכך מחלישים את מבנה החלבון. קיימות מספר בעיות בהשערה זו, שבין השאר לא נתמכת בדי ראיות ניסוייות. כיום מנסים לבדוק האם להיות השינן יון תפקיד בהיותו חומר דנטורטיבי. [1]
לרבים מהחומרים הללו שימושים נוספים במחקר הביוכימי, מלבד דנטורציה, בהם מעוניינים דווקא לשמור על מבנה החלבון. למשל, ממסים אורגנים משמשים לעתים קרובות בתהליכי ניקוי חלבונים. כדי שלא תתרחש דנטורציה מקיימים תהליכים אלה בטמפרטורות נמוכות, המאטות את קצב תנודתם של אטומי החלבון. ההאטה הזו, כפי שנותח לעיל, מפסיקה ברוב החלבונים את הדנטורציה. מכאן שהשפעתם של החומרים הדנטורטיביים איננה מוחלטת, אלא תלויה בתנאי הסביבה.
[עריכה] דנטורציה חלקית ורנטורציה
תהליך הדנטורציה יכול להתרחש במספר רמות. הוא יכול להתרחש כדנטורציה מלאה, המביאה את החלבון לידי קריסה כללית כפי שתואר קודם לכן. אולם יכול להתרחש גם תהליך מתון יותר - דנטורציה חלקית. בדנטורציה חלקית התנאים אינם כה קיצוניים בכדי להביא לקריסת המבנה במלואו, אבל הם כן גורמים לשינוי מבני כלשהו עקב היחלשות האינטראקציות הטבעיות. שינוי קטן זה פוגם גם הוא בפעילות החלבון. כאשר מתקיימת דנטורציה חלקית בתנאים תאיים (in vivo), אנו מוצאים כי בתוך דקות ספורות מרגע התרחשות הדנטורציה, החלבון חוזר לתפקודו התקין. מתרחש אפוא התהליך ההפוך - רנטורציה (או התקפלות מחדש, renaturation). הרנטורציה מתרחשת משום שהמבנה הטבעי של החלבון הוא המבנה היציב ביותר, ולכן הוא נוצר ספונטנית. דנטורציה מלאה גוררת היווצרות אינטראקציות חדשות ואקראיות רבות בין שיירי חומצות האמינו אשר לא מאפשרות רנטורציה בתנאים פיזיולוגיים. למרות זאת, תחת תנאי מעבדה (in vitro), ניתן לגרום לדנטורציה קיצונית על ידי החומרים הדנטורטיביים שהוזכרו לעיל, שלאחריה החלבון חוזר למבנה ותפקוד תקינים.
[עריכה] דנטורציה של חומצות גרעין
[עריכה] מבנה ה-DNA
ערך מורחב – DNA
DNA היא חומצת גרעין המורכבת מתת-יחידות הקרויות נוקלאוטידים. קיימים ארבעה סוגי נוקלאוטידים ב-DNA, הנבדלים אלו מאלו בבסיס החנקני הקיים בהם: אדנין (A), תימין (T), ציטוזין (C), וגואנין (G). הנוקלאוטידים קשורים זה לזה בשרשרת (או גדיל) כשהבסיסים החנקניים פונים החוצה. מולקולת ה-DNA בנויה משני גדילים כאלה הקשורים זה לזה בקשרי מימן המתקיימים בין הבסיסים החנקניים. קשרי המימן נוצרים בין זוגות בסיסים ספציפיים, בין A ל-T או בין G ל-C. בין אדנין לתימין מתקיימים שני קשרי מימן, ואילו בין גואנין לציטוזין מתקיימים שלושה קשרי מימן. לכן מולקולת DNA שכמות הזוגות G ו-C בה גדולה יותר, נחשבת לחזקה יותר. בשל הספציפיות של קשרי המימן, קיימת השלמה בין שני הגדילים של מולקולת DNA, ורצף הבסיסים בגדיל אחד משלים בדיוק לרצף הבסיסים של הגדיל הנגדי – במקום שבגדיל אחד מצוי A, בגדיל המשלים מצוי T וכן הלאה.
מכיוון שקשרי מימן מעניקים למולקולה יציבות תרמודינמית, DNA חד גדילי נוטה להזדווג וליצור קשרי מימן עם גדיל DNA המשלים לו. ככל שההשלמה בין הרצפים גדולה יותר, כן הקשר ביניהם הדוק יותר, שהרי יותר קשרי מימן נוצרים.
[עריכה] דנטורציה ורנטורציה של DNA
דנטורציה של DNA (המכונה גם התכה) משמעה ניתוק קשרי המימן בין שני הגדילים ויצירת מולקולות של DNA חד-גדילי. התהליך ההפוך, בו נוצרים קשרי מימן בין שני גדילי DNA ונוצרת מולקולת DNA דו-גדילית, קרוי רנטורציה או זיווג מחדש. תהליכים אלו עשויים להתרחש לא רק בין שני גדילי DNA אלא גם בין DNA ל-RNA, חומצת גרעין אחרת, בעלת מבנה הדומה ל-DNA חד-גדילי.
קיימות שתי דרכים עיקריות הגורמות לדנטורציה של DNA: חימום, וחשיפה לבסיסים חזקים.
[עריכה] חימום
חימומה של תרכובת גורמת להגברת קצב תנועת האטומים ממנה היא מורכבת. תנועה מוגברת של המולקולה מובילה להחלשה של קשרים לא קוולנטיים שהיא מכילה, כגון קשרי המימן במולקולת ה-DNA. העלאת טמפרטורת התמיסה בה מצויות מולקולות DNA תגרום משום כך להחלשת קשרי המימן בין הגדילים, ומעבר לטמפרטורה מסוימת תגרום להפרדת הגדילים זה מזה ולדנטורציה. ההפרדה מתרחשת בטמפרטורות שבקרבת 100 מעלות צלזיוס, ותלויה ביציבותה האנרגטית של המולקולה טרם החימום, היינו במספר היחסי של קשרי המימן שבה. ככל שהכמות היחסית של זוגות הבסיסים G-C לעומת A-T גבוהה יותר, כמותם של קשרי המימן ליחידת אורך במולקולה עולה, ועל כן טמפרטורת ההתכה של ה-DNA תהיה גבוהה יותר. בנוסף, אם הרצפים בשני הגדילים אינם משלימים במדויק זה לזה, טמפרטורת ההתכה של המולקולה יורדת, כשככל שרמת ההשלמה נמוכה יותר, הגדילים יפרמו בטמפרטורה נמוכה יותר.
קירור איטי של הגדילים לאחר החימום מאפשר לקשרי מימן לשוב ולהיווצר. הדבר מוביל לרנטורציה, והגדילים מזדווגים מחדש על פי רצפי הבסיסים שלהם. קירור מהיר לעומת זאת, לא מאפשר רנטורציה וה-DNA נותר חד גדילי.
[עריכה] בסיס
נוכחותם של בסיסים חזקים בתמיסה מעלה את ה-pH שלה. בדומה למצב בחלבונים, pH גבוה גורם ליינון של מולקולות בתמיסה, ובכך ליצירת מטען חשמלי על אותן מולקולות. לכן, בחשיפת DNA לבסיס חזק דוגמת נתרן הידרוקסידי (NaOH), הבסיס יגרום ליינון של מולקולות ה-DNA. היינון יוצר מטענים שווים בשני הגדילים, אשר דוחים זה את זה. כשה-pH גבוה דיו, הדחייה החשמלית גורמת לניתוק קשרי המימן ולהתרחקות שני הגדילים אחד מן השני, ולמעשה לדנטורציה[2]
לעתים בשיטות מחקריות לדנטורציה על ידי בסיס יתרון על פני דנטורציה בחימום. ראשית, ישנן שיטות בהן לאחר הדנטורציה קושרים את הגדילים הבודדים למשטח ניטרוצלולוז או ניילון, ובסיס מסייע בביצוע קשירה זו. שנית, בסיס עשוי לסייע בהרחקת שאריות RNA מהתמיסה, כשאלה קיימות.
[עריכה] שימושי הדנטורציה בחומצות גרעין
לדנטורציה ורנטורציה של DNA חשיבות גדולה במחקר מעבדתי, כששיטות בסיסיות בהנדסה גנטית מסתמכות על שני תהליכים אלו. לשיטות אלו יישומים מעבר למחקר הגנטי, למשל במחקר האבולוציוני או ביישומים רפואיים.
[עריכה] היברידיזציה
אחת השיטות הנפוצות ביותר הנעזרות בדנטורציה היא ההיברידיזציה. בהיברידיזציה גורמים לדנטורציה של מולקולות DNA, ולאחר מכן מאפשרים לחד-גדילים לעבור רנטורציה עם גדילים של DNA אחרים או גדילי RNA, אשר לעתים קרובות מסומנים כך שיהיה ניתן לזהותם רדיואקטיבית או פלואורסנטית. היברידיזציה יכולה לשמש לצרכים מגוונים. היברידיזציה In situ מבצעת את התהליך על כרומוזומים שלמים, כך שבשלב הרנטורציה ניתן לזווג קטע DNA או RNA ספציפיים מסומנים, וכך לגלות את האזור בכרומוזום בו נמצא הרצף המשלים להם. בשיטת סאת'רן בלוט משתמשים בהיברידיזציה כשגורמים דנטורציה לקטעי DNA קצרים, ואז מזווגים אותם אם קטעי DNA ידועים. ה-DNA יזדווג רק עם קטעי ה-DNA המשלימים לו וכך ניתן לזהות את קטע ה-DNA המבוקש. גישה אחרת של היברידיזציה גורמת לדנטורציה של DNA משני גנים שונים או משני מקורות שונים (ממינים שונים) על ידי חימום ולאחר מכן מאפשרת זיווג של גדילים משני המקורות. גדילי ה-DNA הנוצרים הם בני כלאיים של DNA משני המקורות. חימומם של הגדילים החדשים גורם לדנטורציה שלהם, כשהטמפרטורה בה הגדילים מופרדים מצויה ביחס ישר לרמת ההשלמה בין הגדילים משני המקורות או הגנים. ככל שהטמפרטורה גבוהה יותר וההשלמה גדולה יותר, הדבר מעיד על רצפים דומים יותר בשני הגנים, ולכן על קרבה אבולוציונית ביניהם.
[עריכה] PCR
שיטה חשובה אחרת בהנדסה גנטית היא PCR. זוהי שיטה לבידודם וריבויים של גנים המסתמכת על מחזור שינויי טמפרטורה הגורמים לפרימה ובנייה של גדילי ה-DNA לסירוגין. המחזור מתחיל בחימום התמיסה בה מצוי ה-DNA לטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס הגורמת לדנטורציה. לאחר מכן מקוררת התמיסה לטמפרטורה של 50°C, המאפשרת התחברות של קטעי DNA קצרים לגדילים הפרודים. אלו הם תחלים המשמשים לתחילת הסינתזה של גדילי DNA משלימים חדשים ל-DNA החד-גדילי על ידי האנזים DNA פולימראז. אז הטמפרטורה מועלית ל-75°C, בה DNA פולימראז פעיל, ומסנתז גדילים משלימים. לאחר הסינתזה, מועלית שוב הטמפרטורה ל-95°C, מתרחשת שוב דנטורציה וחוזר חלילה. לאחר מחזורים רבים, מתקבלת כמות גדולה של ה-DNA המבוקש בזמן קצר.
האנזים DNA פולימראז המשמש בתהליך זה מקורו בדרך כלל בחיידק התרמופילי Thermus aquaticus, או חיידקים תרמופיליים דומים, החיים בטמפרטורות גבוהות. הטמפרטורה האופטימלית לפעילותו של החיידק, ולכן גם של האנזימים שבו, גבוהה מ-70°C. הפולימראז התרמופילי לא עובר דנטורציה גם בטמפרטורות של 95 מעלות ולעתים למעלה מזה, אשר הכרחיות לדנטורציה של ה-DNA. תכונה ייחודית זו של החלבון היא אשר מאפשרת את התהליך היעיל של ה-PCR.
[עריכה] הערות שוליים
- ^ דנטורציה על ידי שינן באתר Nature
- ^ [1] מאמר על דנטורציה על ידי בסיס.