ポリメラーゼ連鎖反応
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ポリメラーゼ連鎖反応（ポリメラーゼれんさはんのう、PCR：Polymerase Chain Reaction）は、DNAを増幅するための技術で、PCR法という名称がより一般的である。次の3つの特徴がある。
- ヒトのゲノム（30億塩基対）のような非常に複雑な、しかも極めて微量なDNAの溶液のなかから、自分の望んだ特定のDNA断片（数百から数千塩基対）だけを選択的に増幅させることができる。
- 増幅に要する時間が2時間程度と短い。
- プロセスが単純で、全自動の卓上用装置で増幅できることである。
PCR法そのものや派生した様々な技術は、分子生物学の研究から、医療、犯罪捜査、生物の分類というようなDNAを扱う作業全般で極めて重要な役割を担っている。
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[編集] 原理
2本鎖DNAは、水溶液中で高温になると、変性し1本鎖DNAに分かれる。変性が起こる温度は、DNAの塩基構成および長さ（塩基数）によって異なり、長いDNAほど高い温度が必要になる。 このようにして1本鎖DNAとなった溶液を冷却していくと、相補的なDNAが互いに結合し再び2本鎖となる（アニーリング）。急速に冷却すると、長いDNA同士は2本鎖に再結合しにくいが、短いDNA断片（オリゴヌクレオチド）は結合できる。
PCR法では、増幅対象（テンプレート）のDNA、DNA合成酵素（DNAポリメラーゼ）および大量のプライマーと呼ばれるオリゴヌクレオチドを予め混合し、前述の変性・アニーリングを行う。その結果、長い対象1本鎖DNAの一部にプライマーが結合した形できる。プライマーがDNAよりも圧倒的に多い状況にしておくことで、DNA-プライマーの結合がDNA-DNAの結合より、さらに優先的になる。 この状態でDNAポリメラーゼが働くと、プライマーが結合した部分を起点として1本鎖部分と相補的なDNAが合成される。DNAが合成された後、再び高温してDNA変性から繰り返す。
以上述べてきたようにPCR法は、DNA鎖長の違いによる変性とアニーリングの違いを利用して、温度の上下を繰り返すだけでDNA合成を繰り返し、DNAを増幅する技術である。
･補足
- PCR法開発当初はDNA変性の時にDNAポリメラーゼが失活するためサイクル毎に酵素を追加していたが、現在では好熱菌の耐熱性DNAポリメラーゼを用いることで連続して反応を進めることができる（詳しくは「歴史や背景」の項を参照）。
[編集] 実験手順
･準備
- 増幅対象のDNA領域の両端の塩基配列を決定し、対応するプライマーを人為合成する。このときプライマーは、増幅予定の2本鎖DNAの両鎖それぞれの3'側に結合する相補配列であり、通常20塩基程度。
･反応液調整
- 増幅対象DNA、プライマー、DNAポリメラーゼおよびDNA合成の素材（基質）であるデオキシヌクレオシド三リン酸（dNTP）を混合し、PCR装置にセットする。
･PCRサイクル（図.PCR法の原理 参照）
- この1から3の過程（サイクル）を繰り返すことによって、サイクルごとに目的のDNA領域を倍増させる。nサイクルで2のn乗倍に増えることから、20サイクル程度で百万倍のオーダーに増幅されることになる。
- なお、1サイクル目では目的より長いDNAが合成されるが（図中③と④の間）、2サイクル以降から目的の長さのDNAが増幅することになる（厳密には1サイクル目と同じ長いDNAも合成されるが、無視できる量である）。
･留意点
- この反応の成否は、増幅対象DNAとプライマーの塩基配列、サイクル中の各設定温度・時間などに依存する。それらが不適切な場合、無関係なDNA配列を増幅したり、増幅が見られないことがある。
[編集] 歴史や背景
シータス社のキャリー・マリスが車でガールフレンドと夜道をドライブ中に、当時すでに知られていたオリゴヌクレオチドとDNAポリメラーゼを用いたDNA合成反応を繰り返すことにより核酸の一定領域を増幅することを思いつく。マリスはこの方法をpolymerase-catalyzed chain reactionと名付け、ネイチャー、サイエンスなどの著名な科学雑誌に論文として投稿したが掲載されなかった。1987年に、ようやく、この記念すべき論文はMethods in Enzymology誌に掲載された。
一方、PCR法自体はシータス社の同僚の手により鎌状赤血球症という遺伝性疾患の迅速な診断手段に応用された。サイエンス誌にEnzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. (Saiki et al. Science, Dec 20; 230: 1350-1354, 1985)として報告され、オリジナル論文より前に世界の科学者の注目を集めることとなった。
PCRは、当初、E. coliのDNAポリメラーゼIをズブチリシン処理し5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を除去したクレノー断片を用いて反応を起こすものが大半であった。この酵素を用いた場合は、二本鎖DNA変性のための温度上昇の際に、DNAポリメラーゼが失活し、サーマルサイクルごとに手作業でこの酵素を加えなければならなかった。
シータス社の研究グループは、この欠点を解決するために好熱性の細菌から得た耐熱性DNAポリメラーゼを用いたPCRを開発し、サイエンス誌に発表した(Saiki et al. Science, Jan 29;239(4839):487-91, 1988. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.)。これにより、PCR反応の簡便化、自動化への道が開かれ、分子生物学の研究に欠くことのできない手法として発展し、医学、犯罪捜査など多様な分野へ応用されている。
このように、PCR法の応用、発展にはシータス社グループ（当初はマリスも含む）のはたした役割が大きいのであるが、最初にこの方法を着想し、方向性を示したという業績により、1993年にキャリー・マリスがノーベル化学賞を受賞している。
[編集] 関連項目
- クローニング
- リアルタイムPCR
- 定量PCR
- Colony PCR
- Cycle Sequencing
- Hot Start PCR
- Inverse PCR
- Lamp法
- LA-PCR
- RACE-PCR
- RAPD
- RT-PCR
- EMSA
